猪TGEV抗体与猪PEDV抗体胶体金试纸条制造技术

本发明专利技术公开了一种快速检测PEDV和TGEV血清抗体的试纸条及其制备方法。本发明专利技术试纸条的基本结构为支撑层、加样层、金标蛋白释放垫、检测层与吸收层；该试纸条的金标蛋白与检测线蛋白为通过原核高效表达系统获得的猪流行性腹泻病毒的S1蛋白与猪传染性胃肠炎病毒的包含S蛋白AD位点的重组蛋白，其两条质控线蛋白分别为针对两种蛋白的单克隆抗体。与传统的PEDV与TGEV抗体检测试纸条相比，本发明专利技术的试纸条特异性强，安全性高，操作简单，判定结果快捷。

【技术实现步骤摘要】
猪TGEV抗体与猪PEDV抗体胶体金试纸条
本专利技术属于兽医生物
，涉及一种快速检测抗体技术，尤其涉及猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）与猪流行性腹泻病毒（PEDV）两种抗体的胶体金检测试纸条，同时还涉及该试纸条的制备方法和应用方法。
技术介绍
猪传染性胃肠炎(TransmissibleGastroenteritis,TGE)和猪流行性腹泻(PorcineTransmissibleGastroenteritis,PED)是由冠状病毒科、冠状病毒属的猪传染性胃肠炎病毒(TransmissibleGastroenteritisvirusTGEV)和猪流行性腹泻病毒(PorcineTransmissibleGastroenteritisvirus,PEDV)引起的猪的高度接触性肠道疾病,以秋始、冬春加剧和夏少为主要流行特点，各种年龄猪都可发病,哺乳仔猪病死率很高,10日龄以内仔猪病死率可达100%。近年来，猪腹泻病给我国养猪业带来巨大损失。为了更好的控制这两种猪腹泻疾病，就必须及时了解并掌握猪场病毒的感染情况，因此，开发建立一种可以对猪群同时进行PEDV和TGEV血清抗体检测快速的有效方法是十分必要的。目前已有的检测血清抗体的方法主要有酶联免疫吸附法（ELISA法）和中和试验法，在这些传统的检测方法中存在一些较难克服的缺点，比如：中和试验步骤较为繁琐，检测所需时间较长，且结果判定需要一定的专业技术；ELISA检测法中需要配合酶标仪进行使用，检测的专业人员也需要经过专业培训，同时ELISA检测方法还存在特异性不高稳定性差等特点。因此迫切的需要建立一种省时省力又可以迅速普及的检测方法。免疫胶体金技术目前已广泛应用于临床诊断，在专利技术“检测一种或多种猪病毒性腹泻疾病抗体的试纸条”中就结合免疫胶体金技术进行检测。其金标蛋白为SPA蛋白或待检抗体，检测线固定TGEV与PEDV全病毒，质控线为羊或兔抗SPA产生的IgG蛋白或者羊或兔抗TGEV和PEDV病毒的IgG蛋白。使用全病毒与SPA存在灵敏度不高、特异性不强的特点，如果使用病毒中强抗原性蛋白与其单克隆抗体那么久可以解决其灵敏度与特异性的问题。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于提供一种快速检测PEDV和TGEV血清抗体的试纸条。本专利技术的另一个目的在于提供该试纸条的制备方法。本专利技术试纸条包括支撑层，以及在所述支撑层上依次设置的加样垫、金标蛋白释放垫、检测层和吸收层，其中，所述金标蛋白释放垫包埋有胶体金标记的两种表达蛋白，分别是猪流行性腹泻病毒S1蛋白与含有猪传染性胃肠炎病毒S蛋白AD位点的重组表达蛋白片段；所述检测层上设置有两条检测线和两条质控线，所述两条检测线依次固定所述的S1蛋白及所述的S蛋白AD位点的重组表达蛋白片段，所述两条质控线依次固定有针对两个蛋白片段的单克隆抗体。其中，支撑层优选选用聚乙烯纤维板；加样垫优选选用中速定性滤纸；释放垫优选选用玻璃纤维；检测层优选选用硝酸纤维素膜；吸收层优选选用玻璃纤维。本专利技术提供的所述检测试纸条的制备方法包括以下步骤：1）在检测层的不同位置上分别固定猪流行性腹泻病毒S1蛋白与猪传染性胃肠炎病毒S蛋白的AD位点重组表达蛋白片段及其对应的单克隆抗体，分别形成两条检测线和质控线；2）制备含有两种金标蛋白的释放垫；3）组装支撑层、加样垫、金标蛋白释放垫、检测层和吸收层。1）在检测层的不同位置上依次固定猪流行性腹泻病毒其中，制备金标蛋白释放垫包括如下步骤：以1:100~3000的标记比例将待标记的猪流行性腹泻病毒S1蛋白或猪传染性胃肠炎病毒S蛋白AD位点的重组表达蛋白片段加入到pH7.0~10.0胶体金溶液中，按1:10~500的比例用含0.1~5%BSA的0.001~0.1mol/L磷酸盐缓冲液稀释胶体金标记的S1蛋白或S蛋白AD位点的重组表达蛋白，将稀释后的胶体金标记蛋白液按60μL/cm2的速度喷于玻璃纤维素膜中，4℃低温真空干燥。其中，将包被浓度为0.1~2mg/mL，优选为0.2~0.8mg/mL的猪流行性腹泻病毒S1蛋白按1μL/cm的速度喷于检测层上作为检测线1，将包被浓度为0.1~2mg/mL，优选为0.2~0.8mg/mL的猪传染性胃肠炎病毒S蛋白AD位点的重组表达蛋白按1μL/cm的速度喷于检测层上作为检测线2，将包被浓度为0.1~5mg/mL，优选为0.2~0.8mg/mL的猪流行性腹泻病毒S1蛋白单克隆抗体按1μL/cm的速度喷于检测线下方的检测层上作为质控线1，将包被浓度为0.1~5mg/mL，优选为0.2~0.8mg/mL的猪传染性胃肠炎病毒S蛋白AD位点的重组表达蛋白单克隆抗体按1μL/cm的速度喷于质控线1下方的检测层上作为质控线2，37℃下干燥30min，从而制备检测层。本专利技术中使用的金标蛋白和检测线蛋白均为猪流行性腹泻病毒S1蛋白与含有猪传染性胃肠炎病毒S蛋白AD位点的重组表达蛋白，质控线蛋白则为两种蛋白各自的单克隆抗体，解决了灵敏度与特异性问题，建立起省时省力又能迅速普及的检测方法。与传统的PEDV与TGEV抗体检测方法相比，本专利技术具有明显的优越性：1）特异性强，使用原核表达的PEDVS1蛋白与TGEVS蛋白AD位点的重组表达蛋白和其相应的单克隆抗体，极大的降低了出现假阳性的概率，保证了试纸条特异性和灵敏度，同时，两条质控线也保证了检测结果的准确性；2）安全性高，避免检测过程中病毒的操作；3）操作简便，本专利技术不需要专业的技术人员进行操作和专业仪器的辅助检测；4）判定结果快捷，与传统的中和试验和ELISA试验所用时间相比，本检测结果直观易判定并且检测时间只需10min极为迅速。附图说明图1所示为本专利技术试纸条侧面结构示意图。图中：1为加样垫，2为释放垫，3为检测层，4为吸收层，5为支撑层，6为检测线-1，7为检测线-2，8为质控线-1，9为质控线-2。图2所示是本专利技术金试纸条正面结构示意图。图中：A检测线-1、2与质控线-1、2均显现，为PEDV和TGEV抗体阳性样品检测结果；B检测线-1与两条质控线均显色，其为PEDV抗体阳性样品检测结果；C检测线-2与两条质控线均显色，其为TGEV抗体阳性样品检测结果；D仅有一条质控线显色，为无效检测；E质控线与检测线均不显现，为无效检测。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。实施例1PEDVS1蛋白的表达纯化及其单克隆抗体的制备1、PEDVS1蛋白的表达纯化①目的基因的提取与扩增本胶体金试纸条选择的金标蛋白为PEDVS蛋白中反应原性较好的片段S1蛋白，针对国内流行株，根据其对应的S1蛋白基因设计如下引物上游引物：5’-ACGGATCCGATGGCACCAGGTGATC-3’下游引物：5’-CTGAATTCATGACTGTCCATGACTC-3’使用试剂盒（ROCHE试剂盒）提取猪流行性腹泻病毒的RNA。具体操作步骤：在1.5mL的EP管中加入200μL病毒液和400μL含有PolyA的BindingBuffer，混匀静置1min后转移入高效过滤管中，8000×g离心15s弃去液体；加入过滤管中500μLInhibitorRemovalBuffer8000×g离心1min，弃去液体；加入过滤管中450μLWashBuffer80本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种猪流行性腹泻病毒抗体与猪传染性胃肠炎病毒抗体胶体金快速检测试纸条，包括支撑层，以及在所述支撑层上依次设置的加样垫、金标蛋白释放垫、检测层和吸收层，其特征在于，所述金标蛋白释放垫包埋有胶体金标记的两种表达蛋白，分别是猪流行性腹泻病毒S1蛋白与猪传染性胃肠炎病毒S蛋白的AD位点重组表达蛋白；所述检测层上设置有两条检测线和两条质控线，所述两条检测线依次固定所述的S1蛋白及所述的S蛋白的AD位点重组表达蛋白片段，所述两条质控线依次固定有针对两个蛋白片段的单克隆抗体。

【技术特征摘要】
1.一种猪流行性腹泻病毒抗体与猪传染性胃肠炎病毒抗体胶体金快速检测试纸条，包括支撑层，以及在所述支撑层上依次设置的加样垫、金标蛋白释放垫、检测层和吸收层，其特征在于，所述金标蛋白释放垫包埋有胶体金标记的两种重组表达蛋白，分别是猪流行性腹泻病毒S1蛋白与猪传染性胃肠炎病毒S蛋白的AD位点重组表达蛋白；所述检测层上设置有两条检测线和两条质控线，所述两条检测线依次固定所述的S1蛋白及所述的S蛋白的AD位点重组表达蛋白片段，所述两条质控线依次固定有针对两个蛋白片段的单克隆抗体，其中，将包被浓度为1mg/mL的猪流行性腹泻病毒S1蛋白按1μL/cm的速度喷于检测层上作为检测线1，将包被浓度为0.5mg/mL的猪传染性胃肠炎病毒S蛋白的AD位点重组表达蛋白按1μL/cm的速度喷于检测层上作为检测线2，将包被浓度为1mg/mL的猪流行性腹泻病毒S1蛋白单克隆抗体按1μL/cm的速度喷于检测线下方的检测层上作为质控线1，将包被浓度为0.5mg/mL的猪传染性胃肠炎病毒S蛋白的AD位点重组表达蛋白单克隆抗体按1μL/cm的速度喷于质控线1下方的检测层上作为质控线2，37℃下干燥30min，从而制备检测层。2.如权利要求1所述的试纸条，其特征在于，支撑层选用聚乙烯纤维板；加样垫选用中速定性滤纸；释放垫选用玻璃纤维；检测层选用硝酸纤维素膜；吸收层选用玻璃纤维。3.权利要求1或2所述的试纸条的制备方法，其包括如下步骤：1）在检测层的不同位置上分别...

【专利技术属性】
技术研发人员：于倩倩，王贵华，于萍萍，侯艳红，陈翠云，赵亚荣，
申请(专利权)人：北京大北农科技集团股份有限公司动物医学研究中心，北京大北农科技集团股份有限公司，北京科牧丰生物制药有限公司，福州大北农生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：