猪圆环病毒2型ELISA抗原检测试剂盒及其制备方法和其应用技术

本发明专利技术涉及一种猪圆环病毒2型ELISA抗原检测试剂盒及其制备方法和其应用。其中，所述检测试剂盒含有：包被抗PCV2-Cap蛋白的多克隆抗体的酶标板、封闭液、样品稀释液、抗原标准品、HRP标记的抗PCV2-Cap蛋白的单克隆抗体的二抗、浓缩洗涤液、酶底物A溶液、酶底物B溶液和终止液，其中，所述抗原标准品为纯化的重组猪圆环病毒2型核衣壳蛋白（PCV2-Cap蛋白）。本发明专利技术试剂盒的特异性达100%，灵敏度高达4ng/ml，可用于猪群PCV2抗原检测和PCV2疫苗产品的定量检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种检测试剂盒，具体涉及一种猪圆环病毒2型ELISA抗原检测试剂盒及其制备方法和其应用。
技术介绍
猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2, PCV2)是引发断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaningmultisystemic wasting syndrome, PMWS)的主要病原。除了引发 PMWS外，PCV2还与仔猪先天性震颤、猪皮炎肾炎综合征、猪呼吸道综合征(PDNS)、母猪繁殖障碍等疾病相关。自1996年在加拿大首次发现PMWS以来，PCV2感染引起的相关疾病已经在全世界广泛存在。截止目前，我国养猪业受到PCV2感染的危害日益突出。因此，研制PCV2 抗原检测试剂盒的临床需求日益迫切。目前，国内外采用的PCV2检测方法主要包括病毒分离培养、间接免疫荧光、免疫酶单层实验(MPA)、原位杂交(ISH)、聚合酶链式反应(PCR)等。尽管这些方法可以检测 PCV2，但存在使用不便，操作繁琐，耗时长，不易普及等缺陷。CN102183650A公开了一种猪圆环病毒2型ELISA抗体检测试剂盒，该试剂盒采用双单抗结合技术检测PCV2抗体。CN1584597A公开了一种猪圆环病毒2型抗原或抗体ELISA检测试剂盒，其中，所述的抗原检测试剂盒使用双单抗夹心法，包被的抗体为原核表达的蛋白制备所得，并仅能依靠检测孔的深浅来判断强阳性、阳性、弱阳性和阴性等定性检测结果。该文献公开的试剂盒至今还没有市场化，分析原因可能是试剂盒的特异性或敏感性不能满足市场检测的需要。 为此，急需研究一种能够高效、定量检测PCV2的方法。CN201110440750. 7公开了一种猪圆环病毒2型亚单位疫苗及其制备方法和其应用，该申请公开的内容全文作为本申请的参考。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种猪圆环病毒2型ELISA抗原检测试剂盒，所述检测试剂盒含有包被抗PCV2_Cap蛋白的多克隆抗体的酶标板、封闭液、样品稀释液、抗原标准品、HRP标记的抗PCV2-Cap蛋白的单克隆抗体的二抗、浓缩洗涤液、酶底物A溶液、酶底物B溶液和终止液，其中，所述抗原标准品为纯化的重组杆状病毒表达的形成病毒样颗粒 (VLPs)的猪圆环病毒2型核衣壳蛋白(PCV2-Cap蛋白)，所述酶底物A溶液为3，3’-5，5’-四甲基联苯胺溶液，所述的酶底物B溶液为含有双氧水的乙酸钠缓冲溶液。本专利技术的优选技术方案中，所述的包被抗PCV2_Cap蛋白的多克隆抗体的酶标板孔包被的抗PCV2_Cap蛋白的多克隆抗体为由纯化的重组杆状病毒表达的形成病毒样颗粒(VLPs)的猪圆环病毒2型核衣壳蛋白(PCV2-Cap蛋白)作为抗原免疫实验兔后纯化血清所得，所 述抗PCV2-Cap蛋白的多克隆抗体的包被量为O.1 μ g-5 μ g/孔，包被稀释液为O. 05mol/L的碳酸盐缓冲液，其中，所述碳酸盐缓冲液的pH9. 6。本专利技术的优选技术方案中，所述碳酸盐缓冲液的组成为，每升碳酸盐缓冲溶液中含有1. 59g Na2CO3 和 2. 93g NaHCO3。本专利技术的优选技术方案中，所述封闭液选自质量浓度为1-10%的BSA、质量浓度为 1-10%的脱脂牛奶的任一种或其组合。本专利技术的优选技术方案中，所述样品稀释液由质量浓度为O. 1-10%牛血清白蛋白 (BSA)和含有O. 01-0. 05%NaN3的磷酸盐缓冲液(PBS)组成，其中，所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为 O. 01mol/L, ρΗ7· 2-7. 4。本专利技术的优选技术方案中，所述浓缩洗涤液为含有O. 5v/v%吐温-20的磷酸盐缓冲溶液，其中，所述磷酸盐缓冲液的浓度为O. lmol/L, pH7. 2-7. 4。本专利技术的优选技术方案中，所述的酶底物A溶液为10mg/ml的3，3’ _5，5’ -四甲基联苯胺(TMB)溶液；所述的酶底物B溶液为含有O. 012% (质量浓度)双氧水的乙酸钠缓冲溶液，其中，乙酸钠缓冲溶液的浓度为10mg/ml，pH5. O。本专利技术的优选技术方案中，所述终止液为lmol/L H2SO4溶液。本专利技术的优选技术方案中，所述样品稀释液的配制为配制PH7.2-7.4、浓度为O. 01mol/L的磷酸盐缓冲液，再加入BSA和NaN3,使其浓度分别为O. 1_10%BSA和 0. 01-0. 05%NaN3,即得。本专利技术的优选技术方案中，所述浓缩洗涤液的配制为在0. lmol/L PBS溶液中加入吐温-20 (Tween-20)，使得吐温-20的浓度为0. 5v/v%。本专利技术的优选技术方案中，所述的酶底物A溶液为10mg/ml的3，3’ _5，5’ -四甲基联苯胺(TMB)溶液，其配制为称取IOOmg TMB，将其加入到IOml 二甲基亚砜(DMSO)中，完全溶解后，即得。本专利技术的优选技术方案中，所述的酶底物B溶液为0. 012%双氧水的乙酸钠缓冲溶液，其中，乙酸钠缓冲溶液的浓度为10mg/ml，pH5. 0，其配制为称取IOg乙酸钠，溶于IL纯化水，用乙酸调PH5. O,再加入400 μ I浓度为30%Η202，即得。 本专利技术的优选技术方案中，所述显色液用酶底物B溶液100倍稀释酶底物A溶液制得。本专利技术的优选技术方案中，所述的试剂盒中还含有抗原标准品和阴性对照液，其中抗原标准品的配制为用样品稀释液稀释重组PCV2-Cap蛋白，将其配制至lug/ml而得；所述的阴性对照液用样品稀释液100倍稀释不含PCV2抗原的猪阴性血清配制而成。本专利技术的优选技术方案中，所述重组PCV2_Cap蛋白的制备方法包括如下步骤(I)获得本专利技术所述的重组杆状病毒转移载体pFastBac Dual_20RF2 ；(2)同源重组，产生重组杆状病毒DNA ；(3)包装，产生表达PCV2衣壳蛋白的重组杆状病毒；(4)获得本专利技术制备的重组杆状病毒；(5)培养宿主细胞，接种步骤(4)的重组杆状病毒；(6)灭活病毒；(7)分离纯化重组PCV2Cap蛋白。在本专利技术的一个优选技术方案中，所述重组杆状病毒转移载体是分别在PFastBacDual转移载体的PlO启动子和Ppolh启动子(多角体蛋白启动子)之后各插入一个拷贝的PCV2Cap蛋白编码基因0RF2。在本专利技术的一个优选技术方案中，所述的PCV2Cap蛋白编码基因0RF2是完整的、 未经修饰的PCV2b 0RF2。在本专利技术的一个优选技术方案中，所述的PCV2Cap蛋白编码基因0RF2的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。在本专利技术的一个优选技术方案中，所述PCV2Cap蛋白编码基因0RF2分别通过 BamHI/Hind III 和 Kpn I/Xho I 双酶切插入 pFastBac Dual 转移载体中。在本专利技术的一个优选技术方案中，所述重组杆状病毒转移载体为 pFastBacDual_20RF2。在本专利技术的一个优选技术方案中，所述的同源重组是将步骤(I)所述的重组杆状病毒转移载体转化进含穿梭载体Bacmid的大肠杆菌感受态细胞DHlOBac中，产生重组杆状病毒DNA。在本专利技术的一个优选技术方案中，所述的包装是将步骤(2)产生的重组杆状病毒 DNA感染sf9细胞，包装出重组杆状病毒。在本专利技术的一个优选技术方案中，所述重组杆状病毒为rBac_2本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种猪圆环病毒2型ELISA抗原检测试剂盒，所述检测试剂盒含有：包被抗PCV2?Cap蛋白的多克隆抗体的酶标板、封闭液、样品稀释液、抗原标准品、HRP标记的抗PCV2?Cap蛋白的单克隆抗体的二抗、浓缩洗涤液、酶底物A溶液、酶底物B溶液和终止液，其中，所述抗原标准品为纯化的重组杆状病毒表达的形成病毒样颗粒（VLPs）的猪圆环病毒2型核衣壳蛋白（PCV2?Cap蛋白），所述酶底物A溶液为3,3’?5,5’?四甲基联苯胺溶液；所述的酶底物B溶液为含有双氧水的乙酸钠缓冲溶液。

【技术特征摘要】
2011.12.26 CN 201110440750.7;2012.04.10 CN 2012101.一种猪圆环病毒2型ELISA抗原检测试剂盒，所述检测试剂盒含有包被抗PCV2-Cap蛋白的多克隆抗体的酶标板、封闭液、样品稀释液、抗原标准品、HRP标记的抗PCV2-Cap蛋白的单克隆抗体的二抗、浓缩洗涤液、酶底物A溶液、酶底物B溶液和终止液，其中，所述抗原标准品为纯化的重组杆状病毒表达的形成病毒样颗粒(VLPs)的猪圆环病毒2型核衣壳蛋白(PCV2-Cap蛋白)，所述酶底物A溶液为3，3’ -5，5’ -四甲基联苯胺溶液；所述的酶底物B溶液为含有双氧水的乙酸钠缓冲溶液。2.根据权利要求1所述的猪圆环病毒2型ELISA抗原检测试剂盒，所述抗PCV2-Cap蛋白的多克隆抗体为由纯化的重组杆状病毒表达的形成病毒样颗粒(VLPs)的猪圆环病毒2型核衣壳蛋白(PCV2-Cap蛋白)作为抗原免疫实验兔后纯化血清所得，所述抗PCV2-Cap蛋白的多克隆抗体的包被量为O.1 μ g-5 μ g/孔，包被稀释液为O. 05mol/L的碳酸盐缓冲液，其中，所述碳酸盐缓冲液的PH为9. 6。3.根据权利要求2所述的猪圆环病毒2型ELISA抗原检测试剂盒，所述碳酸盐缓冲液的组成为，每升碳酸盐缓冲溶液中含有1. 59g Na2CO3和2. 93g NaHC03。4.根据权利要求1-3任一项所述的猪圆环病毒2型ELISA抗原检测试剂盒，所述封闭液选自质量浓度为1-10%的牛血清白蛋白(BSA)或质量浓度为1-10%的脱脂牛奶的任一或其组合。5.根据权利要求1-4任一项所述的猪圆环病毒2型ELISA抗原检测试剂盒，所述样品稀释液由质量浓度为O. 1-10%牛血清白蛋白和含有O. 01-0. 05%叠氮化钠(NaN3)的磷酸盐缓冲液组成，其中，所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为O. 01mol/L, pH7. 2-7. 4。6.根据权利要求1-5任一项所述的猪圆环病毒2型ELISA抗原检测试剂盒，所述浓缩洗涤液为含有O. 5% (v/v)吐温-20的磷酸盐缓冲溶液，其中，所述磷酸盐缓冲液的浓度为O.lmol/L, ρΗ7· 2-7. 4。7.根据权利要求1-6任一项所述的猪圆环病毒2型ELISA抗原检测试剂盒，所述的酶底物A溶液选自浓度为10mg/ml的3，3’ -5，5’ -四甲基联苯胺溶液；所述的酶底物B溶液含有质量浓度为O. 012%双氧水的乙酸钠缓冲溶液，其中，乙酸钠缓冲溶液的浓度为IOmg/ml, pH 为 5. O。8.根据权利要求1-7任一项所述的猪圆环病毒2型ELISA抗原检测试剂盒，所述终止液为lmol/L的H2SO4溶液。9.根据权利要求1-8任一项所述的猪圆环病毒2型ELISA抗原检测试剂盒，其中，抗原标准品的配制为用样品稀释液稀释重组PCV2-Cap蛋白至lug/ml制成。10.根据权利要求1-9任一项所述的猪圆环病毒2型ELISA抗原检测试剂盒，所述的试剂盒中还含有阴性对照液，所述的阴性对照液为用样品稀释液100倍稀释不含PCV2抗原的猪阴性血清配制而成。11.根据权利要求1-1...

【专利技术属性】
技术研发人员：廖园园，漆世华，朱薇，李建，秦伟，王威，熊媛媛，张萍，秦红刚，李伟，谢红玲，温文生，王桢桢，靖志强，吴玉石，韩兴，刘洁，
申请(专利权)人：武汉中博生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：