新的猪圆环病毒及其共培养细胞株制造技术

本发明专利技术公开了一株新的猪圆环病毒突变株以及其共培养的猪肾细胞株，猪圆环病毒突变株感染细胞发生可视轻微病变，但不致细胞凋亡。筛选的猪肾细胞株携带PCV2病毒，可稳定传代，大量产生病毒，制备的病毒可用于预防和治疗猪圆环病毒病。

【技术实现步骤摘要】
新的猪圆环病毒及其共培养细胞株
本专利技术属于细胞工程与病毒培养
，具体地说，本专利技术涉及猪圆环病毒,及可与猪圆环病毒共培养的PK15细胞株，大量培养制备PCV2病毒的方法及应用。
技术介绍
目前国内正在使用的猪圆环病毒疫苗主要有2种----亚单位苗和全病毒疫苗。亚单位苗虽安全性较好，但生产成本高昂，免疫期短。因此国内绝大部分猪场仍以全病毒疫苗为主。但全病毒疫苗生产亦有其技术瓶颈：（现有的）圆环病毒体外培养的细胞感染能力不高，感染速度慢，病毒在不同细胞个体中的复制速度差异极大，病毒培养效价很难在短时间内上升到理想状态，为解决该难题，所有生产者都在其培养工艺中增加一个用D-氨基葡萄糖处理，使细胞停留于细胞分裂的S期，以此保证病毒扩增的程序（严伟东《猪病专题2010年学术年会论文集》1184-1188）。但该程序不仅增加了原材料投入，而且增多了生产环节和人力投入，增加了废弃物排放量，使生产成本至少增加1倍以上，即便如此，国内许多厂家用此方法生产的生产的圆环病毒疫苗，其病毒效价在104以下，免疫效果较差。也有人采取筛选对圆环病毒高度敏感细胞系培养圆环病毒其病毒含量均在106以上，免疫效果较好，但生产成本依然高昂。因此如何提高圆环病毒的培养效价是国内厂家目前改良工艺的主攻方向。此外，由于普通圆环病毒在培养过程中不能使细胞发生病变表现（严伟东《猪病专题2010年学术年会论文集》1184-1188），病毒的收获时间确定具有很大的盲目性，这也是造成目前疫苗质量较差的原因之一。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种新的猪圆环病毒PCV2，该病毒在宿主细胞PK15可大量扩增，且可使宿主细胞PK15发生可视轻微病变，但不致细胞凋亡。本专利技术的一个目的是提供一种与猪圆环病毒共培养的PK15细胞株，该细胞携带PCV2病毒，能稳定培养并产生PCV2病毒，细胞株发生可视轻微病变，但能稳定传代培养并产生PCV2病毒。本专利技术的另一个目的是提供一种大量制备PCV病毒的方法。本专利技术的再一个目的是提供新的细胞株在培养猪圆环病毒中的应用本专利技术的再一个目的是猪圆环病毒PCV2在预防和治疗猪圆环病毒病毒中的应用。本专利技术公开了一株新的猪圆环病毒PCV2突变株，其特征在于：PCV2突变株至少有9个位点的碱基突变，具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列，该病毒是猪圆环病毒GY-PCV2株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:V201660。猪圆环病毒GY-PCV2株是从表现猪圆环病毒病症状的病猪体内分离的，分离方法包括下列步骤：（1）无菌操作取下已有明显临床症状的为患猪圆环病毒病的病猪的腹股沟淋巴结，用含2万单位/ml的青霉素和200ug/ml的链霉素混合液洗涤7次以上，并捣成均浆，离心，过虑除菌获得病料液；（2）将病料液与含2%血清的DMEM维持培养基1:1混合；（3）接种混合液至对数生长期的PK-15细胞上进行感染；（4）感染并培养24小时后弃去接种液，加少许3mM的D-氨基葡萄糖铺盖细胞，继续培养2小时，PBS洗涤5次，加入2%血清的DMEM维持液继续培养。（5）培养72小时后，取上清液，用PCV2专用PCR检测试剂盒检测，留下阳性表现最强的细胞继续盲传5代，收获第5代上清液，4000转/分离心30分钟，再次病毒测定确证为强阳性后收集，冻干保存或直接液氮冻存；（6）将步骤（5）收获的病毒液送商业化测序公司进行测序鉴定。测序结果显示，该病毒基因组与所有现已报道的毒株基因组序列99%吻合，与最接近的基因组比对发生了至少9个碱基突变。证明其为PCV2的一个新突变株，命名为GY-PCV2。（7）将步骤（5）收获的病毒液进行攻毒检测攻毒结果显示：GY-PCV2能够使被攻毒猪只发生典型的猪圆环病毒病的症状，从共度猪病料组织分离的病毒经测序验证，与GY-PCV2基因序列完全吻合。（8）将步骤（5）收获的病毒液进行PCV2免疫荧光检测免疫荧光试验结果显示：GY-PCV2显示PCV2免疫荧光强阳性反应，说明其具有PCV2抗原性。（9）对已获得的病毒连续培养20代，收获第20代病毒液，送基因测序公司测定病毒的全基因组序列。测定结果与步骤（6）的全基因组序列100%吻合，说明该PCV2突变株有较强的遗传稳定性。本专利技术将猪圆环病毒GY-PCV2株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:V201660。保藏日是2016年12月5日。本专利技术公开了一株携带PCV2病毒的PK15细胞株，其特征在于，该细胞是PK15细胞经PCV2突变株感染筛选获得，该细胞可稳定培养，在对数生长期后更换维持液继续培养2-5天后细胞发生可视轻微病变，但不致细胞凋亡，该细胞是GY-PCV2-PK15细胞株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:C2016201。GY-PCV2-PK15细胞株是将猪圆环病毒突变株PCV2与猪肾细胞PK15共培养筛选获得，该细胞具有稳定培养的生长特征；进入对数生长期后，更换维持液继续培养2-5天后细胞发生可视轻微病变，但不致细胞凋亡；可连续产生病毒PCV2.本专利技术公开了筛选获得GY-PCV2-PK15细胞株的方法，该方法包括下列步骤：（1）将从CCTCC购买的GDC061猪肾细胞系PK15至对数生长期；（2）接种PCV2突变株至猪肾细胞系PK15，培养24小时后，弃去上清液，用3mmol的D-氨基葡萄糖PBS溶液处理细胞2小时，弃去D-氨基葡萄糖PBS溶液，用PBS洗涤细胞5次。换维持液培养染毒后的细胞72小时后，取上清，用PCV2特异性荧光定量PCR检测试剂盒测定其中PCV2，当测定CT值低于或等于阳性对照的CT值时，证明此时的PK-15细胞已经携带PCV2的PK-15混合细胞；（3）用胰蛋白酶消化，加培养基中和，离心，用培养基调细胞密度在1-10个/ml的细胞悬液，将该细胞悬液接种于96孔培养板中，每孔200ul细胞悬液，培养3日后，在显微镜下观察，留下只有单个细胞克隆生长的培养孔，继续培养；（4）将培养基更换成维持液，以单个细胞克隆培养过程中是否出现“拉网式”病变作为病毒是否出现感染的选择指标进行目标克隆筛选。单个细胞克隆长满培养孔后，按照1：2比例传代细胞，新传代的细胞分别接种于2块不同的新培养板中，做好对应编号标记，当2块培养板中的细胞均已长满细胞孔，其中1块板的细胞继续传代，另1块板，将其细胞培养基更换成维持液，继续培养72小时后，观察细胞是否出现拉网式病变，将那些出现病变的细胞连同上清液冻融3次，反复吹吸均匀后取样，用病毒DNA提取专用试剂盒提取DNA，以PCV2荧光定量PCR检测试剂盒作PCV2的定量PCR检测，留下CT值最小的对应编号的细胞继续传代，直至选择到CT值最小而细胞又能稳定传代的细胞克隆，其中一株细胞株可稳定传代，且可大量产生PCV2病毒，此细胞株命名为GY-PCV2-PK15细胞株。本专利技术将GY-PCV2-PK15细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:C2016201。保藏日是2016年12月5日。本专利技术还公开了大量制备猪圆环病毒的方法。该方法包括下列步骤：1)用常规方法接种培养GY-PCV2-PK15细胞株至对数生长期，细胞长满单层2)用维持液更换培本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株猪圆环病毒PCV2突变株，其特征在于：PCV2突变株至少9个位点的碱基突变，具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，该病毒是猪圆环病毒GY‑PCV2株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:V201660。

【技术特征摘要】
1.一株猪圆环病毒PCV2突变株，其特征在于：PCV2突变株至少9个位点的碱基突变，具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列，该病毒是猪圆环病毒GY-PCV2株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:V201660。2.一株大量产生权利要求1所指的猪圆环病毒PCV2突变株的细胞株，其特征在于，该细胞株由PK15细胞经PCV2突变株感染筛选获得，该细胞可稳定培养，培养至对数生长期更换维持液继续培养2-5天后细胞发生可视轻微病变，但不致细胞凋亡，该细胞是GY-PCV2-PK15细胞株，保藏于中国典型培养物保藏中心...

【专利技术属性】
技术研发人员：高其双，彭霞，夏瑜，谭珺隽，杨俊红，程百炼，桑奥文，雷长宁，王利燕，
申请(专利权)人：武汉市工程科学技术研究院，武汉市农业科学技术研究院畜牧兽医科学研究所，
类型：发明
国别省市：湖北,42