本发明专利技术公开了含猪圆环病毒2型ORF2基因的重组腺病毒在核酸扩增检测中作为标准样品的应用。本发明专利技术利用腺病毒重组技术，制备了一种内含猪圆环病毒2型ORF2基因的重组腺病毒，将该重组腺病毒用做核酸扩增检测方法(NAT)的标准样品，该标准样品具有稳定、制备简单、无生物安全风险的特性，病毒粒子结构与猪原核病毒大体类似，可全程质控病毒DNA提取和扩增检测过程，具有一定量值等特性，适用于猪圆环病毒2型核酸扩增检测方法的质量控制，以及检测试剂和实验室相关能力的评定。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于动物疫病检测
，涉及一种含猪圆环病毒2型0RF2基因的重组 腺病毒在核酸扩增检测中作为标准样品的应用。
技术介绍
猪圆环病毒2型（porcine circovirus type 2, PCV2)呈世界性分布，在家猪和野 猪体内均有发现。目前认为PCV2是全球范围内危害养猪业的一种重要病原，可引起猪的多 种疾病，称为PCV2相关性疾病（PCV2_associated diseases, PCVAD)。PCVAD包括断奶仔猪 多系统消耗综合症（post-weaning multisystemic wasting syndrome, PMWS)，猪皮炎和肾 病综合征（porcine dermatitis and nephropathy syndrome, F*DNS)和繁殖障碍等疾病。 PCV2感染可造成猪群免疫力下降，可导致多种疫苗免疫失败，并导致猪只死亡率增加，据报 道PCV2感染可导致猪场猪只死亡率的增加从2-3%到14-30%不等，对养猪业影响巨大。使 用快速、灵敏的PCV2病毒检测方法用于养猪场疫情监测非常重要。 PCV2属于圆环病毒科（Circoviridae)圆环病毒属（Circovirus)，是一种小而无 囊膜、二十面体、共价闭合、环状的为单股DNA病毒，基因组大小1. 7kb。PCV2主要的保守序 列位于0RF2基因，而且PCV1和PCV2基因序列最大的差异也位于0RF2基因内，故目前检测 PCV2的NAT方法均以0RF2作为靶标进行设计。目前，基于核酸扩增检测方法（NAT)的特异 和高效，国内外报道了很多NAT方法和试剂用于猪场PCV2快速检测。但由于NAT检测方法 属于相对复杂的生物测定方法，对于同样的样品，因DNA提取方法效率的不同，寡核苷酸引 物、探针的效率不同，不同品牌Taq DNA聚合酶扩增效率的不同都会给检测结果带来差异， 甚至出现不同的结果，进而影响结果的判定。 为保证检测质量，评估不同NAT检测方法效力和实验室检测能力，研制均匀、稳 定，可进行量值传递的标准样品用于PCV2的检测质控非常必要。但有关PCV2NAT检测的标 准样品的研究鲜有报道。目前用于PCV2NAT检测的质控品为灭活病毒和质粒DNA制备，或 制备复杂且需要生物安全设施，或虽制备简单，但不能质控DNA提取过程，而且易造成气溶 胶污染。因此均存在明显不足之处，不能满足实际需求。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有质控样品或标准物质的不足，利用腺病毒重组技术， 制备了一种内含猪圆环病毒2型0RF2基因的重组腺病毒，将该重组腺病毒用做核酸扩增检 测方法（NAT)的标准样品，该标准样品具有稳定、制备简单、无生物安全风险的特性，病毒 粒子结构与猪原核病毒大体类似、可用于针对猪圆环病毒2型NAT检测方法和试剂盒的质 量控制和评价。 为达到上述目的，本专利技术采取的技术方案为： 本专利技术提供了含猪圆环病毒2型0RF2基因的重组腺病毒在猪圆环病毒核酸扩增 检测中作为标准样品的应用。 本专利技术所述的含猪圆环病毒2型0RF2基因的重组腺病毒为二十面体病毒粒子结 构，与猪圆环病毒2型结构基本一致，而且腺病毒背景清楚，使用安全方便，在猪圆环病毒 核酸扩增检测中作为标准样品使用可全程质控病毒DNA提取和扩增检测。 本专利技术提供的含猪圆环病毒2型0RF2基因的重组腺病毒是通过如下方法制备： 1)获得用于猪圆环病毒2型检测的0RF2基因序列，如序列表中SEQ ID N0 :1所 示； 所述0RF2基因可以通过合成或者RT-PCR扩增获得，克隆于质粒载体上，例如 PMD19-T，该片段是猪圆环病毒2型NAT检测方法和试剂盒检测的区域。 2)将通过步骤1)获得的PCV20RF2基因的序列克隆于腺病毒穿梭载体上，例如 pacAd5CMV K-NpA，获得重组穿梭质粒，例如CMV-PCV2-0RF2 ; 在本专利技术的一个实施方案中：使用Kpn I和Hind III对重组质粒pMD19-T-0RF2 和腺病毒穿梭载体pacAd5CMV K-NpA双酶切后，经连接转化构建CMV-PCV2-0RF2重组穿梭 质粒，将构建好的质粒经PCR与酶切鉴定，由北京英潍捷基贸易有限公司测序鉴定。 3)将步骤2)获得的重组穿梭质粒与骨架质粒使用限制性内切酶线性化，纯化后 共转染HEK293T细胞，经连续传代获得稳定增殖的重组腺病毒； 在本专利技术的一个具体实施方案中：应用Pac I对重组腺病毒穿梭质粒 CMV-PCV2-0RF2与骨架质粒pacAd59. 2-100线性化，经胶回收纯化后，共转染HEK293T细 胞。同时，对穿梭质粒CMV-GFP与骨架质粒pacAd59. 2-100进行相同操作，作为转染对照 组；正常的J1EK293T作为细胞对照。当转染细胞出现70%以上CPE，且对照组GFP出现大 量荧光时，收集各组细胞，记为P0代。经反复冻融3次后，分装保存于-80°C。将P0代 pacAd5CMV-PCV2-0RF2接种于HEK293细胞中进行连续传代，对第7代重组腺病毒进行鉴定。 4)对所述重组腺病毒鉴定后，于HEK293细胞上进行大量培养，收集病毒，加入冻 干保护剂，分装，真空状态下冷冻干燥； 具体地，将第7代pacAd5CMV-PCV2-0RF2接毒细胞、转染对照pacAd5CMV-GFP接毒 细胞以及正常J1EK293细胞，分别1000g/min离心5min，弃去上清，200 y LPBS重悬细胞，分 别提取DNA和RNA。对于提取的RNA，利用DNase I消化其中可能残留的病毒DNA。采用PCR 和RT-PCR分别进行扩增鉴定，扩增产物由北京英潍捷基贸易有限公司测序鉴定。 进一步地，将大量培养的第7代pacAd5CMV-0RF2接毒细胞反复冻融3次后， 1000g/min离心10min去除沉淀，按照1%加入海藻糖作为冻干保护剂，无菌条件下按照 0. 5mL/瓶分装于西林瓶中，真空状态下冷冻干燥24h。 5)将含猪圆环病毒2型0RF2基因的重组腺病毒经均匀性、稳定性检验后，通过荧 光定量PCR方法和TCID 5。测定进行定值，即得内含猪圆环病毒2型0RF2基因的重组腺病毒 标准样品。 具体地，将内含猪圆环病毒2型0RF2基因的重组腺病毒冻干后，抽样分别通过 荧光PCR和TCID 5。测定，结果经单因子方差分析，结果显示对于Ct值，F(20,9) = 2. 21， <FaQ5(2. 39);对于TCID5。值，F(10,9) = 1.75, <FaQ5(3.02)对于表明样品中被检物是均匀 的。不同条件下放置3个月，采用成对双样本均数-t检验进行统计分析结果显示，对于Ct 值数据，t值分别为1. 59和0. 87 ;对于TCID5。数据，t值分别为0. 55和0. 59。均<t。.。5 (2. 13) 表明冻干后样品稳定性良好；定值研究表明标准样品PCV20RF2基因含量为8. 17X 109GEq/ mL。在 HEK293 细胞上的 TCID5。为 3. 56X 10 7/0. 05mL。 本专利技术制备的含猪圆环病毒2型0RF2基因重组腺病毒标准样品显著优点是： 1) PCV2主要的保守序列位于0本文档来自技高网...
【技术保护点】
含猪圆环病毒2型ORF2基因的重组腺病毒在猪圆环病毒核酸扩增检测中作为标准样品的应用。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张鹤晓，张伟，谷强，刘环，林祥超，高志强，乔彩霞，蒲静，张利峰，
申请(专利权)人：北京出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：北京;11
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