检测猪圆环病毒2型Cap蛋白的单克隆抗体及试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种猪圆环病毒2型竞争ELISA抗体检测试剂盒。所述试剂盒中包括酶标记的由保藏编号为CGMCC NO.10205的杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体。本发明专利技术还公开了利用所述单克隆抗体建立的一种检测猪血清PCV2抗体的竞争ELISA方法，该方法先用PCV2阳性血清包被ELISA板以捕获PCV2抗原，然后与待测猪血清抗体及HRP标记的单抗3A5进行反应，通过测定酶标单抗显示竞争ELISA检测结果。该方法与IPMA方法对237份试验猪血清样品进行了平行试验，两种方法检测符合率为94.1％，且该方法的敏感性为92.6％，特异性为98.4％，与其它几种猪病毒参考阳性血清无交叉反应。本发明专利技术试剂盒具有操作简便、特异性好和敏感性高等特点，为PCV2流行病学调查及血清抗体检测提供了一种有效技术手段。

【技术实现步骤摘要】
检测猪圆环病毒2型Cap蛋白的单克隆抗体及试剂盒
本专利技术涉及一种试剂盒，特别涉及一种猪圆环病毒2型竞争ELISA抗体检测试剂盒，属于免疫学领域。
技术介绍
猪圆环病毒2型(Porcinecircovirustype2，PCV2)属于圆环病毒科圆环病毒属成员，是迄今为止动物病毒中最小的病毒之一，直径为17nm，二十面体对称，无囊膜。病毒基因组由单股闭合环状DNA组成，含有1766～1769核苷酸(OlveraA,CorteyM,SegalésJ.Molecularevolutionofporcinecircovirustype2genomes:Phylogenyandclonality[J].Virology,2007,357(2):175～185；HuangL.P.,LuY.H.,WeiY.W.,etal.Identificationofonecriticalaminoacidthatdeterminesaconformationalneutralizingepitopeinthecapsidproteinofporcinecircovirustype2.BMCMicrobiol.2011a,11:188.)。PCV2基因组主要包含2个大的开放阅读框架(ORF1和ORF2)(CheungAK.Transcriptionalanalysisofporcinecircovirustype2.Virology,2003,305:168-180.)。ORF1编码复制酶相关蛋白，参与病毒的复制，ORF2编码Cap蛋白，是病毒的唯一结构蛋白，具有良好的免疫原性，是该病毒诊断方法研制的理想靶抗原(LiuC,IharaT,NunoyaT,etal.DevelopmentofanELISAbasedonthebaculovirus-expressedcapsidproteinofporcinecircovirustype2asantigen[J].JVetMedSci.,2004,66(3):237～242.)。虽然PCV2只有一个血清型，然而却分为多种基因型，包括PCV2a、PCV2b、PCV2c和PCV2d等。这些基因型的差异使其Cap蛋白抗原性存在差异。PCV2多抗不能识别这些差异，只有单抗可以区分(SahaD.,HuangL.P.,BussalleuE.,etal.Antigenicsubtypingandepitopes’competitionanalysisofporcinecircovirustype2usingmonoclonalantibodies.Vet.Microbiol.2012,157:13-22；HuangL.P.,LuY.H.,WeiY.W.,etal.Identificationofonecriticalaminoacidthatdeterminesaconformationalneutralizingepitopeinthecapsidproteinofporcinecircovirustype2.BMCMicrobiol.2011a,11:188.)。PCV2是引起临床上发生PMWS疾病的主要病原体，但其致病机制尚未完全阐明。Meerts等(PeterMeerts,GeraldMisinzo,DavidLefebvre,JensNielsen,AnetteCharlotteSKristensen,HansJNauwynck.Correlationbetweenthepresenceofneutralizingantibodiesagainstporcinecircovirus2(PCV2)andprotectionagainstreplicationofthevirusanddevelopmentofPCV2-associateddisease[J].BMCVetRes2006,2:6–16.)研究表明，猪体内缺乏PCV2中和抗体与病毒复制能力增强有关，因体内中和抗体效价较低，不能够完全中和体内病毒增殖，最终发展成为临床PMWS疾病。为了进一步证实这种观点，Fort等(FortM,OlveraA,SibilaM,SegalésJ,MateuE:Detectionofneutralizingantibodiesinpostweaningmultisystemicwastingsyndrome(PMWS)-affectedandnon-PMWS-affectedpigs[J].VetMicrobiol2007,125:244–255.)进行了系统试验，应用血清中和试验、IPMA和定量PCR检测PMWS猪、没有PMWS表现而PCV2阳性猪以及PCV2阴性猪，结果发现：中和抗体与血清中病毒载量呈负相关，中和抗体增长的同时病毒数量明显下降；PMWS猪血清中和抗体水平明显低于没有PMWS表现而PCV2阳性猪。可见中和抗体在清除血液循环中PCV2和疾病康复过程中发挥重要作用。因此，体液免疫在PCV2相关疾病方面可能占有重要地位。用于PCV2血清抗体检测的方法主要IIF、IPMA、间接ELISA、阻断ELISA、竞争ELISA和免疫胶体金技术等，其中以IIF和IPMA最为经典和常用，尽管这两种方法具有诸多优点，但是在结果判定方面存在一定的主观性，难于实现高通量和自动化检测需要使其推广受到限制。基于重组蛋白建立的间接ELISA具有较好的特异性，但其敏感性低于IPMA(张朝霞，刘长明，危艳武，等，猪圆环病毒2型ELISA抗体检测试剂盒的研制及应用[J].中国预防兽医学报，2008，30(7)：548-551；张志慧，危艳武，吴洪丽，等，猪圆环病毒2型几种ELISA抗体检测试剂盒的比较与应用[J].中国预防兽医学报，2014，36(2)：129-133)，上述几种方法检测结果不能直接反应PCV2中和抗体。本专利技术利用PCV2中和性单抗建立的竞争ELISA法可以直接检测血清中和抗体，具备规模化批量生产的优势，可实现自动化检测要求，特异性强，敏感性与IPMA相当，为该病毒疫苗免疫及临床发病动物血清抗体的检测提供了一种有效手段。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的在于提供一种猪圆环病毒2型竞争ELISA抗体检测试剂盒，该试剂盒操作简便，特异性好，敏感性高，为PCV2流行病学调查及血清抗体检测提供了一种有效技术手段；本专利技术的第二个目的在于提供一种使用以上所述的试剂盒在制备检测猪血清猪圆环病毒2型抗体试剂中的应用；本专利技术的第三个目的在于提供用于建立以上所述试剂盒的单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株。为了实现本专利技术的目的，本专利技术提供了如下技术方案：本专利技术以纯化的PCV2作为免疫原，分别对6周龄雌性BALB/c鼠进行3次免疫。首免，每只鼠注射腹腔50μg(0.5ml)的纯化病毒；间隔3周进行二免，免疫原、剂量和方法同上；再间隔2周相同方法加强免疫。按常规方法无菌采取免疫鼠脾细胞，用PEG1450进行融合。采用IPMA方法筛选抗PCV2单抗，具体操作方法参照文献(刘长明，张超范，危艳武，等.猪圆环病毒2型免疫过氧化物酶单层细胞试验抗体检测试剂盒的研究与应用[J].中国预防兽医学报,2007,29(8)：62本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种猪圆环病毒2型竞争ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，包括采用间接的捕获包被法包被猪圆环病毒2型抗原的酶标板和酶标记的抗猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体；所述的单克隆抗体由杂交瘤细胞株分泌产生，所述的杂交瘤细胞株命名为PCV2‑Cap‑3A5，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.10205。

【技术特征摘要】
2015.03.24 CN 20151013011041.一种猪圆环病毒2型竞争ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，包括采用间接的捕获包被法包被猪圆环病毒2型抗原的酶标板和酶标记的抗猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体；所述的单克隆抗体由杂交瘤细胞株分泌产生，所述的杂交瘤细胞株命名为PCV2-Cap-3A5，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.10205。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述采用间接的捕获包被法包被猪圆环病毒2型抗原为先用猪圆环病毒2型阳性血清包被ELISA板以捕获猪圆环病毒2型抗原；所述猪圆环病毒2型抗原为PCV2/LG株培养物，毒价为1×105TCID50/ml；所述酶为辣根过氧化酶。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述猪圆环病毒2型阳性血清的包被稀释倍数为1：1000；所述捕获猪圆环病毒2型抗原的作用时间为1h。4.根据权利要求1-3任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性对照、阳性对照、稀释液、显色液、洗涤液和终止液。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述阴性对照为猪圆环病毒2型阴性血清；所述阳性对照为猪圆环病毒2型阳性血清；所述稀释液为含有1％牛血清白蛋白的PBST缓冲液；所述显色液为ABTS工作液；所述洗涤液为PBST缓冲液；所述终止液为1％的NaF溶液。6.权利要求1-5任一项所述的试剂盒在制备检测猪血清猪圆环病毒2型抗体试...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄立平，刘长明，危艳武，朱海波，
申请(专利权)人：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23