检测猪圆环病毒2型抗体的ELISA试剂盒制造技术

一种检测猪圆环病毒2型抗体的ELISA试剂盒，该试剂盒依双抗原夹心 ELISA原理研制而成，包括ELISA抗原预包被板条、洗涤液、100倍浓缩的酶 标抗原、酶标稀释液、底物显色液、终止液及标准PCV2阴、阳性血清。本试 剂盒采用酶标抗原代替酶标抗抗体，酶标抗原不会与非特异性吸附于ELISA板 的抗体结合，同时待检测血清标本不需预先稀释，直接与工作浓度的酶标抗原 混合后即可直接用于测定，操作简单，所需检测时间更少。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种检测猪圆环病毒2型(PCV2)抗体的ELISA试剂盒，属于 兽医生物
用于猪圆环病毒2的抗体检测，以此判断猪群中圆环病毒 2型感染情况以及对该病的流行情况以及免疫效果进行监测。
技术介绍
猪圆环病毒2型(porcine circovirus 2， PCV2)与猪群中发生的许多疾病 密切相关，诸如断奶仔猪多系统衰竭综合症(Post weaning multisystem wasting syndrome, PMWS)猪皮炎肾炎综合症(Porcine dermatitis and n印hropathy syndrome, PDNS)、母猪繁殖障碍、增生性肠炎、仔猪先天性震颤、 猪呼吸道病综合征等，我们将由PCV2引起的多种病症统称为PCVD (porcine circovirus disease, PCVD)，在诸多PCVD中，以PMWS最为常见，P丽S的主要引 起猪渐进性消痩、腹泻、呼吸道症状、皮肤苍白或出现黄疸、生产性能降低。 PCV2除了本身引起猪病外，因侵害猪的免疫系统，抑制猪的免疫功能，还能与 猪蓝耳病、猪流感、猪支原体肺炎、副猪嗜血杆菌和猪链球菌病等常见猪疫病 病原相互作用，加重这些病的危害。目前PCV2已经在世界范围内广泛传播，给 养猪业造成了巨大的经济损失。PCV2的实验室诊断方法主要包括病理组织学检测、病毒的分离与鉴定、 PCR、间接免疫荧光试验(IFA)、原位杂交(ISH)、免疫组化法(IHC)等，但这些 方法主要用于检测病原，且对试验条件和技术要求较高。近年来，国内外不少科研单位建立了检测PCV2抗体的酶联免疫吸附试验 (ELISA)，该方法具有操作简单、敏感性高、快速、易标准化等优点，尤其适合于大规模血清样品的检测。而目前用于检査PCV2抗体的ELISA方法主要是 间接法，该方法的缺点是血清中所含的高浓度的非特异性抗体可直接吸附到固 相载体上，有时也可吸附到包被抗原的表面，从而导致本底较高或者可能出现 假阳性的结果。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是针对上述现有技术的不足，提供一种依据双抗原夹心ELISA的原理而研制的检测猪圆环病毒2型抗体的ELISA试剂盒， 用于猪圆环病毒2型抗体的检测。为了解决上述技术问题，本专利技术所采用的技术方案是 一种检测猪圆环病 毒2型抗体的ELISA试剂盒，所述试剂盒依双抗原夹心ELISA原理研制而成， 包括a. ELISA板条每个试剂盒包含4块真空包装的ELISA板，每块板含可拆 卸的已包被检测抗原的ELISA微孔板条，规格为8孔X 12条；该包被抗原是依 据GenBank中PCV2的基因序列(登录号AY943819)，设计两条引物，上游 引物为GCGAATTCATGGGCATCTTCAACACCCGCCTCTC ; 下游引物为 GCGTCGACTTACTTAGGGTTAAGTGGGGGGTC:通过PCR的方法从猪PCV2基因组中扩 增不含核定位信号的C邻基因，将其克隆到pET32-a(+)原核表达载体中，构建 pET32a-Cap重组表达载体；转化至大肠杆菌BL21 (DE3)中，参照Novagen公 司pET Syetem Manual表达重组Cap融合蛋白，用亲和层析法纯化表达的融合 蛋白制得；b. 洗涤液10倍浓縮的pH为7. 4的含0. 5% (体积百分比)吐温-20的 1M PBS溶液200ml;c. IOO倍浓縮的酶标抗原500ul:将上述纯化的Cap融合蛋白用猪源肠激酶酶切去掉融合部分，并再次使用亲和层析柱纯化获得不含核内化信号肽的Cap蛋白，并用超滤管将其浓縮至2.0mg/ml，并采用改良过碘酸钠法将辣根过 氧化物酶偶联于Cap蛋白上；d. 酶标稀释液pH为7.4的0. 1M PBS溶液50ml;e. 底物显色液50ml:称取200mg四甲基联苯胺，用100ml无水乙醇或DMSO 溶解后，以双蒸水定容至1000ml，配置显色液A;称取9.33g柠檬酸，14.6g 磷酸氢二钠，加入0. 75%(质量体积比)过氧化氢尿素6. 4ml，调pH值到5. 0 5.4，双蒸水定容至1000ml，配制显色液B;显色液A、 B等体积混合，即为显 色剂；量取111. 2ml 18M浓硫酸稀释定容至1000ml即用；f. 终止液2M硫酸溶液50ml;g. 标准PCV2阴、阳性血清各1.0ml。上述采用改良过碘酸钠法将辣根过氧化物酶偶联于Cap蛋白上，具体是于 5mg/ml HRP溶液中，加入0. 2ml新配的0. 1M阪104溶液，室温下避光搅拌20 分钟，对pH4.4的lmM醋酸钠缓冲液4。C透析过夜，加20 u 1 0. 2M pH9. 5碳酸 盐缓冲液，使以上醛化的HRP的pH升高到9.0 9.5，然后立即加入2ml待标 记的Cap蛋白至lml 0. 01M碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2小时，加0. lml 新配的4mg/ml NaBH4液，混匀，4C放置2小时，对pH7. 4的0. 15M PBS4。C透 析过夜，在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，4C放置1小时后3000rpm离 心半小时，弃上清；沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量PH7. 4 的0. 15M的PBS中，对pH7. 4的0. 15MPBS缓冲盐水透析，去除铵离子后， 10000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶标抗原。双抗原夹心ELISA由于具有更高的敏感性和特异性，在人医上已广泛使用。 与间接ELISA的主要不同之处在于用酶标抗原代替酶标抗抗体，酶标抗原不会与非特异性吸附的抗体结合，同时检测标本不需稀释，可直接用于测定，因此其 敏感性和特异性相对高于间接法。在此基础上，本专利技术将酶标抗原与待检血清 同时加入到检测孔中，使反应一步完成。应用本试剂盒对猪繁殖与呼吸综合症病毒标准阳性血清、猪瘟病毒标准阳 性血清、伪狂犬病毒标准阳性血清、口蹄疫病毒标准阳性血清、猪细小病毒标 准阳性血清、大肠杆菌标准阳性血清进行检测，结果均为阴性。说明本试剂盒 所用诊断抗原与其它病原抗体之间无交叉反应。而本专利技术的ELISA试剂盒与西班牙INGENASA公司试剂盒比较INGENASA公司 检测PCV2抗体的间接ELISA试剂盒(INGEZIM CIRCO IgG 11.PCV.K1)在欧美等 养猪业发达国家被广泛应用，是目前国际上公认的一种检测PCV2抗体的优质诊 断试剂盒。分别用本试剂盒与INGENASA公司检测PCV2抗体的间接ELISA试剂盒 (INGEZIM CIRCO IgG 11.PCV.K1)检测94份临床送检血清，比较其结果的一致 性，结果见表l。表1本试剂盒与INGENASA公司试剂盒的比较试验 INGENASA 公司本试剂盒检测结果 PCV2试剂盒检测阳性阴性 阴性符合率阳性符合率总符合率结果阳性48头份 43头份 5头份-- 89.58%91. 49%阴性46头份 3头份 43头份93.47% —从本专利技术的ELISA试剂盒与INGENASA公司试剂盒的对比试验来看，大部 分被检样品中的最终判定结果一致，只有少数弱阳性血清和0D45。值接近判定标准的阴性血清的检测结果不一致，这可能与两种ELISA检测系统所选本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测猪圆环病毒２型抗体的ＥＬＩＳＡ试剂盒，其特征在于：所述试剂盒依双抗原夹心ＥＬＩＳＡ原理研制而成，包括：　ａ．ＥＬＩＳＡ板条：每个试剂盒包含４块真空包装的ＥＬＩＳＡ板，每块板含可拆卸的已包被检测抗原的ＥＬＩＳＡ微孔板条，规格为８孔×１２条；该包被抗原是依据ＧｅｎＢａｎｋ中ＰＣＶ２的基因序列（登录号：ＡＹ９４３８１９），设计两条引物，上游引物为：ＧＣＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＧＣＡＴＣＴＴＣＡＡＣＡＣＣＣＧＣＣＴＣＴＣ；下游引物为：ＧＣＧＴＣＧＡＣＴＴＡＣＴＴＡＧＧＧＴＴＡＡＧＴＧＧＧＧＧＧＴＣ；通过ＰＣＲ的方法从猪ＰＣＶ２基因组中扩增不含核定位信号的Ｃａｐ基因，将其克隆到ｐＥＴ３２－ａ（＋）原核表达载体中，构建ｐＥＴ３２ａ－Ｃａｐ重组表达载体；转化至大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中，参照Ｎｏｖａｇｅｎ公司ｐＥＴＳｙｅｔｅｍ　Ｍａｎｕａｌ表达重组Ｃａｐ融合蛋白，用亲和层析法纯化表达的融合蛋白制得；　ｂ．洗涤液：１０倍浓缩的ｐＨ为７．４的含０．５％（体积百分比）吐温－２０的１Ｍ　ＰＢＳ溶液２００ｍｌ；　ｃ．１００倍浓缩的酶标抗原５００μｌ：将上述纯化的Ｃａｐ融合蛋白用猪源肠激酶酶切去掉融合部分，并再次使用亲和层析柱纯化获得不含核内化信号肽的Ｃａｐ蛋白，并用超滤管将其浓缩至２．０ｍｇ／ｍｌ，并采用改良过碘酸钠法将辣根过氧化物酶偶联于Ｃａｐ蛋白上；　ｄ．酶标稀释液：ｐＨ为７．４的０．１Ｍ　ＰＢＳ溶液５０ｍｌ；　ｅ．底物显色液５０ｍｌ：称取２００ｍｇ四甲基联苯胺，用１００ｍｌ无水乙醇或ＤＭＳＯ溶解后，以双蒸水定容至１０００ｍｌ，配置显色液Ａ；称取９．３３ｇ柠檬酸，１４．６ｇ磷酸氢二钠，加入０．７５％（质量体积比）的过氧化氢尿素６．４ｍｌ，调ｐＨ值到５．０～５．４，双蒸水定容至１０００ｍｌ，配制显色液Ｂ；显色液Ａ、Ｂ等体积混合，即为显色剂；量取１１１．２ｍｌ１８Ｍ浓硫酸稀释定容至１０００ｍｌ即用；　ｆ．终止液：２Ｍ硫酸溶液５０ｍｌ；　ｇ．标准ＰＣＶ２阴、阳性血清各１．０ｍｌ。...

【技术特征摘要】
1、一种检测猪圆环病毒2型抗体的ELISA试剂盒，其特征在于所述试剂盒依双抗原夹心ELISA原理研制而成，包括a.ELISA板条每个试剂盒包含4块真空包装的ELISA板，每块板含可拆卸的已包被检测抗原的ELISA微孔板条，规格为8孔×12条；该包被抗原是依据GenBank中PCV2的基因序列(登录号AY943819)，设计两条引物，上游引物为GCGAATTCATGGGCATCTTCAACACCCGCCTCTC；下游引物为GCGTCGACTTACTTAGGGTTAAGTGGGGGGTC；通过PCR的方法从猪PCV2基因组中扩增不含核定位信号的Cap基因，将其克隆到pET32-a(+)原核表达载体中，构建pET32a-Cap重组表达载体；转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，参照Novagen公司pET Syetem Manual表达重组Cap融合蛋白，用亲和层析法纯化表达的融合蛋白制得；b.洗涤液10倍浓缩的pH为7.4的含0.5％(体积百分比)吐温-20的1M PBS溶液200ml；c.100倍浓缩的酶标抗原500μl将上述纯化的Cap融合蛋白用猪源肠激酶酶切去掉融合部分，并再次使用亲和层析柱纯化获得不含核内化信号肽的Cap蛋白，并用超滤管将其浓缩至2.0mg/ml，并采用改良过碘酸钠法将辣根过氧化物酶偶联于Cap蛋白上；d.酶标稀释液pH为7.4的0.1M PBS溶液50ml；e.底物显色液50ml称取200mg四甲基联苯胺，用100ml无水乙醇或DMSO溶解...

【专利技术属性】
技术研发人员：余兴龙，葛猛，李润成，蒋大良，罗维，
申请(专利权)人：余兴龙，葛猛，李润成，蒋大良，罗维，
类型：发明
国别省市：43