本发明专利技术涉及基于抗重组UL51蛋白抗体的胶体金试纸，其由吸收垫、底板、硝基纤维膜、金标垫和样品垫组成，所述硝基纤维膜上的测试线由浓度≥1mg/mLA动物抗重组UL51蛋白抗体IgG包被而成，所述金标垫由浓度≥2mg/mL胶体金标记B动物抗重组UL51蛋白抗体IgG包被而成，所述硝基纤维膜上的对照线由浓度≥1mg/mL?C动物抗B动物IgG包被而成；所述胶体金试纸的制备方法包括硝基纤维膜上测试线和对照线喷制、金标垫制备及胶体金免疫层析试纸条的组装；本试纸用于检测鸭瘟病毒抗原的检测灵敏度和特异性高，本制备方法操作简单实用，本运用首次将抗重组UL51蛋白抗体制备成胶体金试纸用于检测鸭瘟病毒抗原。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及动物医学领域中鸭瘟病毒抗原的检测检测，特别涉及基于抗重组UL51蛋白抗体的胶体金试纸及其制备方法和应用。
技术介绍
鸭瘟(Duck plague，DP)，又称鸭病毒性肠炎(Duck viral enteritis，DVE)，是鸭、鹅、天鹅等雁形目动物的一种急性接触性传染病，其致病特征是血管损伤、组织出血、消化道和淋巴器官损伤。该病可导致商品水禽的产蛋量下降和死亡，对野生水禽也有不同的致死率。DP的病原为DPV(Duck plague virus，DPV)，DPV是一种泛嗜性全身性感染的病毒，目前大多数学者把其暂时列为α疱疹病毒亚科，但尚未分属。目前，已报道的DPV检测方法有病毒分离鉴定、聚合酶链式反应(PCR)、荧光实时定量PCR、间接免疫酶组化法、间接免疫荧光法、电镜观察、原位杂交、间接原位PCR法、血清中和试验(SNT)、琼脂凝胶扩散试验、酶联免疫吸附试验(ELISA)、反向被动血凝试验、微量固相放射免疫测定法、生物素标记寡核苷酸探针原位检测、地高辛标记核酸探针法和光敏生物素标记法等，这些方法各有特点。但是，传统的病毒分离鉴定方法大约需4～5d，且方法繁琐，费时费力。一些免疫学方法以及PCR方法也往往需要特殊的仪器、设备以及熟练的技术人员。此外，许多血清学检测方法都是基于纯化的DPV全病毒产生的抗体来检测DPV，由于病毒纯化的复杂性和纯化后的病毒中会掺杂有许多宿主细胞成分，而导致许多假阳性结果出现。胶体金(ICS)法是20世纪80年代发展起来的一种将胶体金免疫技术和色谱层析技术相结合的固相膜免疫分析方法，它是在免疫胶体金渗滤法基础上发展而来的。近年来已在生物医学各领域得到了日益广泛的应用，如寄生虫病、病毒病、细菌病和药物残留等的检测。该方法操作简单、特异性强，并可在15min内很直观地判断出待测物的有无，大大提高了检测的速度。ICS法现已成为当今最快速、敏感的免疫学检测技术之一，特别适合于广大基层兽医人员以及大批量检测和大面积普查等，因此该技术具有巨大的发展潜力和应用前景。随着分子生物学的飞速发展，对蛋白功能的研究日趋增强，特别是对有免疫原性蛋白的研究日益增多，以克隆表达的重组蛋白作为包被原检测病毒抗血清的ELISA方法和胶体金免疫层析法已被大量报道，同时也有以表达的重组蛋白制备的抗体检测病毒抗原的报道。但是，基于重组UL51蛋白的抗体检测鸭瘟病毒抗原的ICS法尚未见报到，重组UL51蛋白的抗体是否与DPV发生强烈的免疫反应尚需证实。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供一种胶体金试纸，该试纸是基于抗重组UL51蛋白抗体标记并严格控制金标垫上免疫胶体金与硝基纤维膜上抗体的标记浓度的基础上制备而成，其特异性和灵敏性高。-->为实现上述目的，本专利技术的技术方案为：基于抗重组UL51蛋白抗体的胶体金试纸，由底板、硝基纤维膜、样品垫、金标垫和吸收垫组成，硝基纤维膜上有测试线和对照线，所述硝基纤维膜上的测试线由浓度大于或等于1mg/mL的A抗重组UL51蛋白抗体IgG包被而成，对照线由浓度大于或等于1mg/mL C抗BIgG包被而成；所述金标垫由胶体金标记浓度大于或等于2mg/mL的B抗重组UL51蛋白抗体IgG包被而成；所述A抗重组UL51蛋白抗体IgG为免疫学研究中常规实验动物中除鸭外的任一种动物抗重组UL51蛋白抗体IgG，所述B抗重组UL51蛋白抗体IgG为免疫学研究中常规实验动物中除A外的任一种动物抗重组UL51蛋白抗体IgG，所述C抗B IgG为免疫学研究中常规实验动物中除A和B外的任一种动物抗B IgG。进一步，所述A抗重组UL51蛋白抗体IgG中的A为鼠抗重组UL51蛋白抗体IgG，所述B抗重组UL51蛋白抗体IgG为兔抗重组UL51蛋白抗体IgG，所述C抗B IgG为羊抗兔IgG；进一步，所述硝基纤维膜上的测试线由浓度等于1mg/mL的A抗重组UL51蛋白抗体IgG包被而成，对照线由浓度等于1mg/mL C抗B IgG包被而成；所述金标垫包由胶体金标记浓度等于2mg/mL的B抗重组UL51蛋白抗体IgG包被而成；本专利技术的目的之二在于提供所述胶体金试纸的制备方法，该方法简单实用。为实现上述目的，本专利技术的技术方案为：上述的基于抗重组UL51蛋白抗体的胶体金试纸的制作方法，具体步骤为：a硝基纤维膜上测试线和对照线的喷制：将浓度大于或等于1mg/mL的A抗重组UL51蛋白抗体IgG喷点于硝基纤维膜上形成测试线，将浓度大于或等于1mg/mLC抗B IgG喷点于硝基纤维膜上形成对照线，干燥后低温密封保存备用；b金标垫的制备：将玻璃纤维素膜浸于胶体金标记浓度大于或等于2mg/mL的B抗重组UL51蛋白抗体IgG中，再将该膜浸于玻璃纤维素膜处理液中封闭非特异性结合位点，干燥后得金标垫；c胶体金免疫层析试纸条的组装：分别将硝基纤维膜、样品垫、金标垫和吸收垫依次粘在所述底板上，硝基纤维膜上所述对照线靠近吸收垫端，所述测试线靠近样品垫端，再切割成一定宽度的试纸条，密封包装，干燥低温保存。进一步，所述测试线与所述对照线的距离为0.7厘米，所述测试线与所述对照线距硝基纤维膜的边距分别为0.9厘米。本专利技术的目的之三在于提供所述胶体金试纸的运用，所述运用能够保证在灵敏性和特异性较高的情况下快速检测鸭瘟病毒抗原。为实现上述目的，本专利技术的技术方案为：胶体金试纸在制备鸭瘟病毒抗原检测试纸中的应用。本专利技术的有益效果在于：本胶体金试纸敏感性高，可检测到最低含量为0.125μg的DPV病毒蛋白；运用该试纸对含DPV的DEF培养液、含DHV的鸭胚尿囊液、含RA的菌体培养液和含E.coli菌体培养液，结果显示仅含DPV的DEF培养液可见两条清晰的红色条带，其它样品液均仅在C线处出现一条清晰的红色条带，表明此方法具有良好的特异性；另外，运用本试纸检测鸭瘟病毒具有良好的批内及批间重复性；本-->方法制备的试纸至少可在4℃或25℃保存半年，本运用首次将抗重组UL51蛋白抗体IgG制备成胶体金试纸用于检测鸭瘟病毒。附图说明为了使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本专利技术作进一步的详细描述，其中：图1-A为DPV UL51基因的PCR扩增：M指DL2000相对分子质量标准，1指以正常DEF基因组DNA为模板的PCR扩增产物，2指以DPV CHv毒株基因组DNA为模板的PCR扩增产物(箭头所示的是其分子量大小，约为760bp)；图1-B为重组质粒pMD18-UL51的双酶切鉴定：M指相对分子质量标准III，1指重组质粒pMD18-UL51用EcoR I和Xho I双酶切得到的两个片段(箭头所示小片段的分子量大小约为760bp)；图1-C为重组表达载体pET28a-UL51的双酶切鉴定：M指相对分子质量标准III，1指重组表达载体pET28a-UL51，2指重组表达载体pET28a-UL51用EcoR I和Xho I双酶切得到的两个片段(箭头所示小片段的分子量大小约为760bp)。图2-A为重组表达蛋白的SDS-PAGE鉴定：M为蛋白质相对分子质量标准，1为阴性对照(未加IPTG诱导)，2为IPTG诱导(箭头所示的蛋白质分子量大小约为34KD)；图2-B为诱导剂IPTG不同终浓度诱本文档来自技高网...
【技术保护点】
基于抗重组ＵＬ５１蛋白抗体的胶体金试纸，由底板、硝基纤维膜、样品垫、金标垫和吸收垫组成，硝基纤维膜上有测试线和对照线，其特征在于：所述硝基纤维膜上的测试线由浓度大于或等于１ｍｇ／ｍＬ的Ａ抗重组ＵＬ５１蛋白抗体ＩｇＧ包被而成，对照线由浓度大于或等于１ｍｇ／ｍＬＣ抗ＢＩｇＧ包被而成；所述金标垫由胶体金标记浓度大于或等于２ｍｇ／ｍＬ的Ｂ抗重组ＵＬ５１蛋白抗体ＩｇＧ包被而成；所述Ａ抗重组ＵＬ５１蛋白抗体ＩｇＧ为免疫学研究中常规实验动物中除鸭外的任一种动物抗重组ＵＬ５１蛋白抗体ＩｇＧ，所述Ｂ抗重组ＵＬ５１蛋白抗体ＩｇＧ为免疫学研究中常规实验动物中除Ａ外的任一种动物抗重组ＵＬ５１蛋白抗体ＩｇＧ，所述Ｃ抗ＢＩｇＧ为免疫学研究中常规实验动物中除Ａ和Ｂ外的任一种动物抗ＢＩｇＧ。
【技术特征摘要】
1.基于抗重组UL51蛋白抗体的胶体金试纸，由底板、硝基纤维膜、样品垫、金标垫和吸收垫组成，硝基纤维膜上有测试线和对照线，其特征在于：所述硝基纤维膜上的测试线由浓度大于或等于1mg/mL的A抗重组UL51蛋白抗体IgG包被而成，对照线由浓度大于或等于1mg/mL C抗B IgG包被而成；所述金标垫由胶体金标记浓度大于或等于2mg/mL的B抗重组UL51蛋白抗体IgG包被而成；所述A抗重组UL51蛋白抗体IgG为免疫学研究中常规实验动物中除鸭外的任一种动物抗重组UL51蛋白抗体IgG，所述B抗重组UL51蛋白抗体IgG为免疫学研究中常规实验动物中除A外的任一种动物抗重组UL51蛋白抗体IgG，所述C抗B IgG为免疫学研究中常规实验动物中除A和B外的任一种动物抗B IgG。2.根据权利要求1所述的基于抗重组UL51蛋白抗体的胶体金试纸，其特征在于：所述A抗重组UL51蛋白抗体IgG中的A为鼠抗重组UL51蛋白抗体IgG，所述B抗重组UL51蛋白抗体IgG为兔抗重组UL51蛋白抗体IgG，所述C抗B IgG为羊抗兔IgG。3.根据权利要求1所述的基于抗重组UL51蛋白抗体的胶体金试纸，其特征在于：所述硝基纤维膜上的测试线由浓度等于1mg/mL的A抗重组UL51蛋白抗体IgG包被而成，对照线由...
【专利技术属性】
技术研发人员：程安春，汪铭书，沈婵娟，陈孝跃，
申请(专利权)人：四川农业大学实验动物工程技术中心，
类型：发明
国别省市：51
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