本发明专利技术特别涉及基于重组UL51蛋白的胶体金免疫层析试纸及其制备方法，所述胶体金免疫层析试纸中硝基纤维膜上的测试线由浓度≥2mg/mL的重组UL51蛋白包被而成，对照线由浓度≥1mg/mL的兔免疫球蛋白包被而成，金标垫由胶体金标记的≥2mg/mL重组UL51蛋白和≥2mg/mL的羊抗兔免疫球蛋白的混合液包被而成；试纸的制作方法包括硝基纤维膜上测试线和对照线的喷制、金标垫的制备及胶体金免疫层析试纸条的组装；本发明专利技术还涉及试纸在检测鸭瘟病毒抗体中的运用；本试纸用于检测鸭瘟病毒抗体的检测灵敏度和特异性高，本制备方法操作简单实用，本运用首次将抗重组UL51蛋白制备成胶体金试纸用于检测鸭瘟病毒抗体。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及动物医学领域中鸭瘟病毒抗体的检测，特别涉及基于重组UL51蛋白的胶体金免疫层析试纸及其制备方法和应用。
技术介绍
鸭瘟(Duck plague，DP)，又称鸭病毒性肠炎(Duck viral enteritis，DVE)，是鸭、鹅、天鹅等雁形目动物的一种急性接触性传染病，其致病特征是血管损伤、组织出血、消化道和淋巴器官损伤。该病可导致商品水禽的产蛋量下降和死亡，对野生水禽也有不同的致死率。DP的病原为DPV(Duck plague virus，DPV)，DPV是一种泛嗜性全身性感染的病毒，目前大多数学者把其暂时列为α疱疹病毒亚科，但尚未分属。目前，已报道的DPV检测方法有病毒分离鉴定、聚合酶链式反应(PCR)、荧光实时定量PCR、间接免疫酶组化法、间接免疫荧光法、电镜观察、原位杂交、间接原位PCR法、血清中和试验(SNT)、琼脂凝胶扩散试验、酶联免疫吸附试验(ELISA)、反向被动血凝试验、微量固相放射免疫测定法、生物素标记寡核苷酸探针原位检测、地高辛标记核酸探针法和光敏生物素标记法等，这些方法各有特点。但是，传统的病毒分离鉴定方法大约需4～5d，且方法繁琐，费时费力。一些免疫学方法以及PCR方法也往往需要特殊的仪器、设备以及熟练的技术人员。此外，许多血清学检测方法都是基于纯化的DPV全病毒产生的抗体来检测DPV，由于病毒纯化的复杂性和纯化后的病毒中会掺杂有许多宿主细胞成分，而导致许多假阳性结果出现。随着分子生物学的飞速发展，对蛋白功能的研究日趋增强，特别是对有免疫原性蛋白的研究日益增多，以克隆表达的重组蛋白作为包被原检测病毒抗血清的ELISA方法和胶体金免疫层析法已被大量报道。但是，基于重组UL51蛋白的鸭瘟病毒抗体检测方法尚未报到，重组UL51蛋白是否与抗DPV阳性血清发生强烈的免疫反应、是否可用于鸭瘟病毒抗体的检测尚需证实。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供一种基于重组UL51蛋白为抗原的胶体金免疫层析试纸检测鸭瘟病毒抗体，所述重组UL51蛋白的获得是通过构建原核表达质粒pET28a-UL51、转化并发酵培养，收集到了大量的含有重组UL51蛋白的菌体沉淀；为保证包被蛋白成分单一，降低非特异性结合，接着对重组UL51蛋白进行了纯化；且将纯化的蛋白再依次分步梯度透析，以降低尿素浓度使该蛋白恢复其空间结构，复性后的蛋白具有较好的抗原性；同时，用Western blotting分析证实该蛋白可与抗DPV阳性血清发生强烈的免疫反应；进一步确定重组UL51蛋白标记浓度、兔免疫球蛋白的包被浓度及金标垫的包被参数后，制备了胶体金免疫层析试纸，该试纸检测鸭瘟病毒抗体的特异性、灵敏性较高。-->为实现上述目的，本专利技术的技术方案为：基于重组UL51蛋白的胶体金免疫层析试纸，由底板、硝基纤维膜、样品垫、金标垫和吸收垫组成，硝基纤维膜上有测试线和对照线，所述硝基纤维膜上的测试线由浓度大于或等于2mg/mL的重组UL51蛋白包被而成，对照线由浓度大于或等于1mg/mL的兔免疫球蛋白包被而成；所述金标垫由胶体金标记的浓度大于或等于2mg/mL的重组UL51蛋白和胶体金标记的浓度大于或等于2mg/mL的羊抗兔免疫球蛋白组成的混合液包被而成。进一步，所述的基于重组UL51蛋白的胶体金免疫层析试纸，所述硝基纤维膜上的测试线由浓度等于2mg/mL的重组UL51蛋白包被而成，对照线由浓度等于1mg/mL的兔免疫球蛋白包被而成，所述金标垫由胶体金标记的浓度等于2mg/mL的重组UL51蛋白和胶体金标记的浓度等于2mg/mL的羊抗兔免疫球蛋白组成的混合液包被而成。本专利技术的目的之二在于提供所述胶体金免疫层析试纸的制备方法，该方法简单实用。为实现上述目的，本专利技术的技术方案为：所述胶体金免疫层析试纸的制备步骤具体步骤为：a硝基纤维膜上测试线和对照线的喷制：将浓度≥2mg/mL的重组UL51蛋白喷点于硝基纤维膜上形成测试线，将浓度≥1mg/mL的兔免疫球蛋白喷点于硝基纤维膜上形成对照线，干燥后低温密封保存备用；b金标垫的制备：将玻璃纤维素膜浸于由胶体金标记的浓度≥2mg/mL的重组UL51蛋白和胶体金标记的浓度≥2mg/mL的羊抗兔免疫球蛋白组成的混合液中，再将该膜浸于玻璃纤维素膜处理液中封闭非特异性结合位点，干燥后得金标垫；c胶体金免疫层析试纸条的组装：分别将硝基纤维膜、样品垫、金标垫、吸收垫依次粘在所述底板上，硝基纤维膜上所述所述对照线靠近吸收垫端，所述测试线靠近样品垫端，再切割成一定宽度的试纸条，密封包装，干燥低温保存；进一步，所述测试线与所述对照线的距离为0.7厘米，所述测试线与所述对照线距硝基纤维膜的边距分别为0.9厘米。本专利技术的目的之三在于提供所述胶体金免疫层析试的运用，所述运用能够保证在灵敏性和特异性较高的情况下快速检测鸭瘟病毒抗体。为实现上述目的，本专利技术的技术方案为：所述的胶体金免疫层析试纸在制备鸭瘟病毒抗体检测试纸中的运用。有益效果：本胶体金试纸敏感性高，即使将DPV弱毒疫苗免疫鸭的阳性血清按体积稀释到128倍，也可以被本胶体金免疫层析试纸检测到；运用该试纸分别检测非免疫鸭阴性血清、鸭DPV阳性血清、鸭DHV阳性血清、鸭RA阳性血清和鸭E.coli阳性血清，结果显示仅鸭DPV阳性血清可见两条清晰的红色条带，其它血清均仅在C线处出现一条清晰的红色条带，表明本试纸具有很好的特异性；另外，运用本试纸检测鸭瘟病毒具有良好的批内及批间重复性；本方法制备的试纸至少可在4℃或25℃保存一年，本运用首次将重组UL51蛋白制备成胶体金试纸用于检测鸭瘟病毒抗体。附图说明为了使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本专利技术作-->进一步的详细描述，其中：图1-A为DPV UL51基因的PCR扩增：M指DL2000相对分子质量标准；1指以正常DEF基因组DNA为模板的PCR扩增产物；2指以DPV CHv毒株基因组DNA为模板的PCR扩增产物(箭头所示的是其分子量大小，约为760bp)；图1-B为重组质粒pMD18-UL51的双酶切鉴定：M指相对分子质量标准III，1指重组质粒pMD18-UL51用EcoR I和Xho I双酶切得到的两个片段(箭头所示小片段的分子量大小约为760bp)；图1-C为重组表达载体pET28a-UL51的双酶切鉴定：M指相对分子质量标准III；1指重组表达载体pET28a-UL51，2指重组表达载体pET28a-UL51用EcoR I和Xho I双酶切得到的两个片段(箭头所示小片段的分子量大小约为760bp)。图2-A为重组表达蛋白的SDS-PAGE鉴定：M为蛋白质相对分子质量标准；1为阴性对照(未加I PTG诱导)；2为IPTG诱导(箭头所示的蛋白质分子量大小约为34KD)；图2-B为诱导剂IPTG不同终浓度诱导表达结果：1-7的IPTG浓度分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2mmol/L；图2-C为不同温度诱导pET28a-UL51表达结果：1-3的温度分别为20、30和37℃；图2-D为不同时间诱导pET28a-UL51表达结果：1-7的诱导时间分别为1、2、3、4、5、6、7和8h。图3为重组UL51蛋白的检测：(a)SD本文档来自技高网...
【技术保护点】
基于重组ＵＬ５１蛋白的胶体金免疫层析试纸，由底板、硝基纤维膜、样品垫、金标垫和吸收垫组成，硝基纤维膜上有测试线和对照线，其特征在于：所述硝基纤维膜上的测试线由浓度大于或等于２ｍｇ／ｍＬ的重组ＵＬ５１蛋白包被而成，对照线由浓度大于或等于１ｍｇ／ｍＬ的兔免疫球蛋白包被而成；所述金标垫由胶体金标记的浓度大于或等于２ｍｇ／ｍＬ的重组ＵＬ５１蛋白和胶体金标记的浓度大于或等于２ｍｇ／ｍＬ的羊抗兔免疫球蛋白组成的混合液包被而成。
【技术特征摘要】
1.基于重组UL51蛋白的胶体金免疫层析试纸，由底板、硝基纤维膜、样品垫、金标垫和吸收垫组成，硝基纤维膜上有测试线和对照线，其特征在于：所述硝基纤维膜上的测试线由浓度大于或等于2mg/mL的重组UL51蛋白包被而成，对照线由浓度大于或等于1mg/mL的兔免疫球蛋白包被而成；所述金标垫由胶体金标记的浓度大于或等于2mg/mL的重组UL51蛋白和胶体金标记的浓度大于或等于2mg/mL的羊抗兔免疫球蛋白组成的混合液包被而成。2.根据权利要求1所述的基于重组UL51蛋白的胶体金免疫层析试纸，其特征在于：所述硝基纤维膜上的测试线由浓度等于2mg/mL的重组UL51蛋白包被而成，对照线由浓度等于1mg/mL的兔免疫球蛋白包被而成，所述金标垫由胶体金标记的浓度等于2mg/mL的重组UL51蛋白和胶体金标记的浓度等于2mg/mL的羊抗兔免疫球蛋白组成的混合液包被而成。3.权利要求1或2所述的基于重组UL51蛋白的胶体金免疫层析试纸制作方法，其特征在于：具体步骤为：a硝...
【专利技术属性】
技术研发人员：程安春，汪铭书，沈婵娟，陈孝跃，
申请(专利权)人：四川农业大学实验动物工程技术中心，
类型：发明
国别省市：51
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