本发明专利技术提供一种检测犬恶丝虫抗体胶体金免疫层析试纸条及制备方法，其特点在于：利用胶体金标记的金黄色葡萄球菌A蛋白制作本发明专利技术的金标抗体，即金标垫；再利用犬恶丝虫MTFP蛋白，作为诊断抗原包被硝酸纤维膜（NC膜），作为检测线（T线），兔抗SPA抗体作为质控线(C线)，以上为基础研制出本发明专利技术夹心法检测犬恶丝虫血清抗体的胶体金免疫层析试纸条。本发明专利技术具有方便快捷、试验结果肉眼可见，不需要特殊实验仪器，不需专业技术人员操作等特点，更适合基层单位现场检测。具有高特异性，高敏感性，本发明专利技术利用犬恶丝虫的重组蛋白MTFP作为诊断性抗原，比全蛋白提高了检测的特异性；又采用金黄色葡萄球菌A蛋白作为金标蛋白，由于其可以与抗体的Fc段发生特异性结合，两者的夹心结合既保证了本发明专利技术试纸条的特异性又保证了敏感性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术提供一种检测犬恶丝虫血清抗体的胶体金试纸条检测方法，利用胶体金免疫层析技术检测犬血清内的恶丝虫抗体，属于免疫学检测
技术介绍
犬恶丝虫病在我国几乎各地均有发生，该病不仅可引起犬、狐猝死，还能严重影响狐的毛皮质量，造成严重的经济损失，并且已成为潜在的严重威胁人类健康的新发人兽共患传染病病而受到广泛关注和重视，迄今为止，该病仍没有理想的诊断治疗方法。犬恶丝虫MTFP 基因编码肌球蛋白马达域，即Ⅱ型肌球蛋白。作为细胞骨架的分子马达，是一种多功能蛋白质，其主要功能是为肌肉收缩提供动力。与编码马来丝虫肌球蛋白尾家族蛋白部分序列同源性为 88%。已有研究表明MTFP 编码的蛋白具有良好的免疫原性和反应原性，是诊断犬恶丝虫较好的诊断性抗原。目前，国内外未见利用MTFP蛋白作为诊断抗原建立的胶体金免疫层析试纸条检测方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是公开一种高特异性、高灵敏度、方便快捷的检测犬恶丝虫血清抗体的胶体金免疫层析试纸条及其制备方法，适合于临床诊断及大规模的流行病学调查。本专利技术所述的检测犬恶丝虫抗体胶体金免疫层析试纸条及制备方法，其特点在于：利用胶体金标记的金黄色葡萄球菌A蛋白制作本专利技术的金标抗体，即金标垫；再利用犬恶丝虫MTFP蛋白，作为诊断抗原包被硝酸纤维膜（NC膜），作为检测线（T线），兔抗SPA抗体作为质控线(C线)，以上为基础研制出本专利技术夹心法检测犬恶丝虫血清抗体的胶体金免疫层析试纸条。其中：一、重组蛋白MTFP的克隆、表达及纯化 1、引物的设计与合成根据目的基因序列，设计两对引物：F2：5’–GGATCCCAACTTACGCAGGAAGCA- 3’，下划线为 BamH I 酶切位点；S2：5’–CTCGAGCTCGAGTTAGCAGTAATTGATGCC- 3’，下划线为 Xho I 酶切位点。2、目的基因的扩增以含有MTFP 插入片段的噬菌体基因组作为模板进行PCR扩增，PCR产物进行凝胶回收。3、目的基因与PMD18-T克隆载体的连接将纯化的PCR产物与pMD18-T克隆载体连接。之后进行连接产物的转化及阳性克隆的鉴定。4、目的片段与 pGEX-4T-1 载体的连接与转化将鉴定为阳性的重组质粒pMD18-T-MTFP进行凝胶回收，与pGEX-4T-1 载体进行连接，再转化至BL21感受态，然后进行酶切鉴定及测序鉴定。5、目的基因的原核表达将表达菌活化后，经‰IPTG诱导表达4h之后，收集菌体进行SDS-PAGE，结果表明MTFP蛋白主要以包涵体的形式表达。6、重组蛋白MTFP的纯化将菌体沉淀超声破碎，利用8M尿素法进行纯化，首先用2M尿素反复清洗，最后将蛋白沉淀溶于8M尿素中。经Western blot 验证该蛋白可被犬恶丝虫阳性血清识别。7、重组蛋白的透析复性利用梯度透析的方法对纯化的MTFP蛋白进行透析复性，目的是将其中的尿素去除，以用于下一步划膜。二、胶体金试纸条的组装首先，将包被好检测线和质控线的21mm硝酸纤维素膜粘贴到PVC底板上，再取24mm样品垫、9mm金标垫、32mm吸水纸从下到上依次重叠2mm粘贴于PVC底板上；依次粘贴好后，将试纸板上的各种耗材与PVD底板压紧，用切纸机将组装好的试纸板切成每条宽度为4mm的试纸条即可。本专利技术的积极效果在于：本专利技术具有方便快捷、试验结果肉眼可见，不需要特殊实验仪器，不需专业技术人员操作等特点，更适合基层单位现场检测。具有高特异性，高敏感性，本专利技术利用犬恶丝虫的重组蛋白MTFP作为诊断性抗原，比全蛋白提高了检测的特异性；又采用金黄色葡萄球菌A蛋白作为金标蛋白，由于其可以与抗体的Fc段发生特异性结合，两者的夹心结合既保证了本专利技术试纸条的特异性又保证了敏感性。重复性好，保存期长，4°情况下可保存60天以上。附图说明图1试纸条组装示意图；图2金标抗体透射电镜图；图3试纸条特异性试验结果示意图；图4试纸条灵敏性试验结果示意图。具体实施方式下列实施例旨在进一步举例说明本专利技术的具体方法及应用性，而不是限制本专利技术。实施例1胶体金免疫层析试纸条检测方法的建立（1）胶体金标记SPA的鉴定取金标SPA溶液与透射电镜下观察其状态，主要包括：大小是否相等、形状是否均匀一致、有无聚集情况，金颗粒周围有无蛋白晕等，从而鉴定金标抗体的标记效果。（2）金标垫的选择本专利技术选用4种金标垫分别是聚酯纤维VL68、玻璃纤维RB45、聚酯纤维VL78、聚酯纤维VL98，首先分别滴加金标抗体，观察四种金标垫对金标抗体的吸收情况，以及干燥之后金标抗体在四种金标垫上的分布情况，边缘效应等。（3） NC膜上C线抗体包被浓度的确定将C线抗体稀释成1、0.5、0.25、0mg/ml，每个试纸条包被1ul，T线蛋白包被浓度为1mg/ml，包被1ul，按照常规条件进行操作，观察结果C线的显色情况，确定C线抗体的最佳包被浓度。（4） NC膜上T线蛋白包被浓度的确定将T线蛋白稀释成1、0.5、0.25、0mg/ml，每个试纸条包被1ul，C线抗体包被浓度为1mg/ml，包被1ul，按照常规条件进行操作，观察结果T线的显色情况，确定T线蛋白的最佳包被浓度。、结果（1）胶体金标记SPA的鉴定在透射电镜下观察，发现颗粒大小基本相等，约在40nm左右，形状较为均一，无聚集现象，分散较好，且胶体金颗粒周围存在一圈明显的蛋白晕，表明金标SPA标记成功（见图2）。（2）金标垫的选择结果表明金标SPA在玻璃纤维RB45上分布的更加均匀，边缘效应较小，以玻璃纤维RB45为金标垫的金标抗体释放更为完全，所以选择玻璃纤维RB45为本试验组装试纸条的金标垫。（3） NC膜上C线抗体包被浓度的确定将C线抗体稀释成0、0.25、0.5、1mg/ml，当抗体浓度在0.5mg/ml时，C线显色清晰均匀，而0.25mg/ml时显色较淡，不清晰，故选择0.5mg/ml为C线抗体包被浓度。（4） NC膜上T线蛋白包被浓度的确定将T线蛋白稀释成0、0.25、0.5、1mg/ml，当蛋白浓度在1mg/ml时，T线显色较为清晰均匀，而0.5mg/ml时T线几乎没有显色，故选择1mg/ml为T线蛋白包被浓度。实施例2、胶体金免疫层析试纸条性能测试对试纸条耗材以及T/C线包被量选择完成之后，将试纸条进行组装，为了检测试纸条的工作性能，要对试纸条进行一系列的测试，其中包括特异性试验、灵敏度试验、稳定性试验（稳定性试验中包括重复性试验）。（1）特异性试验分别取犬蛔虫阳性血清，犬等孢球虫阳性血清作对照，犬心丝虫阴性血清作为阴性对照，按照上述建立的胶体金试纸条方法进行操作，观察试纸条显色情况，从而评价试纸条的特异性。（2）灵敏性试验将犬心丝虫阳性血清进行倍比稀释（1:1,1:2,1:4,1:8,1:16,1:32），按常规操作观察试纸条显色情况。当用肉眼无法观察到T线，并且C线依旧清晰可见时，此时的稀释度即为该方法的最低检出浓度。（3）稳定性试验一次性制备试纸条18只，分三个批次，于4℃密封保存。分别在1天、1月、2月这三个时间点，每个时间点取出6只分别对同一阴性样品、同一阳性样品进行3次重复检测，观察三个重复试纸条的显色情况，从而判断试纸条检测的稳定情况。（4）试纸条检测阳性血清符合率试验应用已经建立的本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测犬恶丝虫抗体胶体金免疫层析试纸条，其特征在于：主要包括玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜、吸水纸、PVC底板；金标垫为利用胶体金标记金黄色葡萄球菌A蛋白制作的金标抗体；利用犬恶丝虫MTFP蛋白作为诊断抗原包被硝酸纤维膜（NC膜）作为检测线（T线）；兔抗SPA抗体作为质控线(C线)。
【技术特征摘要】
1.一种检测犬恶丝虫抗体胶体金免疫层析试纸条，其特征在于：主要包括玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜、吸水纸、PVC底板；金标垫为利用胶体金标记金黄色葡萄球菌A蛋白制作的金标抗体；利用犬恶丝虫MTFP蛋白作为诊断抗原包被硝酸纤维膜（NC膜）作为检测线（T线）；兔抗SPA抗体作为质控线(C线)。2.如权利要求1所述的一种检测犬恶丝虫抗体胶体金免疫层析试纸条的制备方法，其特点在于：重组蛋白MTFP的克隆、表达及纯化： 1）引物的设计与合成根据目的基因序列，设计两对引物：F2：5’–GGATCCCAACTTACGCAGGAAGCA- 3’，下划线为 BamH I 酶切位点；S2：5’–CTCGAGCTCGAGTTAGCAGTAATTGATGCC- 3’，下划线为 Xho I 酶切位点；2）目的基因的扩增以含有MTFP 插入片段的噬菌体基因组作为模板进行PCR扩增，PCR产物进行凝胶回收；3）目的基因与PMD18-T克隆载体的连接将纯化的PCR产物与pMD18-T克隆载体连接。3.之后进行连接产物的转化及阳性克隆的鉴定；4）目的片...
【专利技术属性】
技术研发人员：张西臣，姜鑫，侯洪烈，高珺珊，李建华，宫鹏涛，杨举，李赫，李棕松，杨正涛，尹继刚，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22
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