本发明专利技术公开了一种用于检测七带石斑鱼神经坏死病毒抗体的胶体金免疫层析检测试纸及其应用，该试纸包括有底座、衬板、试纸芯和覆盖试纸芯的面板，试纸芯包括样品垫、带有金标抗体的胶体金结合垫、硝酸纤维素反应膜和吸水垫；胶体金结合垫包被有胶体金标记的七带石斑鱼神经坏死病毒MCP重组蛋白；硝酸纤维素膜上设有检测线和对照线，检测线和对照线上分别包被的是七带石斑鱼神经坏死病毒MCP重组蛋白和鼠抗神经坏死病毒MCP重组蛋白单克隆抗体，本发明专利技术提供了用于检测七带石斑鱼神经坏死病毒抗体的MCP重组蛋白的核苷酸序列。本发明专利技术的试纸操作简便、灵敏度高、结果快速、成本低廉，适合养殖场开展七带石斑鱼神经坏死病毒抗体的快速诊断。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于水产动物免疫学检测
，具体涉及一种用于检测七带石斑鱼神经坏死病毒抗体的胶体金免疫层析检测试纸及其应用。
技术介绍
七带石斑鱼（Epinephelus septemfasciatus Thunberg，1793）是我国沿海分布纬度最高的石斑鱼种类，除了具有个体大、生长速度快和经济价值高等特点外，对低温的耐受能力较强，生存水温9~34℃，摄食水温12~32℃，有“冷水石斑”之称，被认为是东北亚温带海域网箱养殖理想海水鱼类品种之一，其苗种繁育技术的突破，可以缓解我国东海北部和黄渤海沿岸网箱适养鱼类品种缺乏的问题，因此备受业界重视。但是尽管国内外研究多年，七带石斑鱼的苗种繁育技术始终不能稳定，在所面临的技术瓶颈中，神病毒性神经坏死病(viral nervousnecrosis，VNN)造成的早期苗种死亡率居高不下是目前最亟待解决的关键问题。病毒性神经坏死病(viral nervousnecrosis，VNN)是目前全球范围内除非洲外海水养殖鱼类危害最严重的病毒性疾病之一，分为SJNNV、TPNNV，BFNNV和RGNVV4种类型，已报道的感染养殖鱼类种类已超过13科近40种。养殖石斑鱼受害尤其严重，受到感染后，早期仔稚鱼死亡率高达100%，中间培育稚鱼死亡率也常常超过50%，即便是体重超过1.5kg的养殖成鱼受到感染后也会死亡。因此，VNN已经成为造成养殖石斑鱼从苗种到养殖大量死亡的主要原因之一。我国是石斑鱼养殖大国，2008年产量达到4.5万t，占世界石斑鱼养殖总产量7.5万t的一半以上，为保障我国石斑鱼养殖这一海水养殖支柱产业的可持续稳定发展，亟需对石斑鱼病毒性神经坏死病的防治技术开展深入研究。病毒性神经坏死病（viral nervousnecrosis，VNN）是由诺达病毒科（Nodaviridae）的一种小RNA病毒引起的，该病毒被称为神经坏死病病毒（nervousnecrosis virus，NNV），NNV的传播主要有两条途径，一是由携带病毒的亲鱼通过配子垂直传播给子代，另外一条途径是同一养殖环境中养殖鱼群体间、不同种类养殖鱼类或者栖息生物间以及从生鲜饵料鱼和生物饵料至养殖群体的水平传播。为了明晰NNV的传播途径和研发出相应的预防技术，目前国内外研究学者已经开发出了多种NNV检测技术，如原位杂交、免疫组织化学方法、荧光抗体技术、细胞培养、ELISA、逆转录转录酶链式聚合反应（RT-PCR）和实时定量PCR等方法。目前在生产实际中较为有效的检测手段均建立在神经坏死病毒外壳蛋白基因核苷酸序列的PCR扩增基础之上，但仍然存在检测成本高、操作繁琐、周期长、需要专用仪器设备等缺点，无法满足养殖现场大规模快速准确检测的需求。胶体金免疫层析技术则是在胶体金标记技术和免疫层析技术发展的基础上，结合了单克隆抗体技术和新材料技术，它以胶体金为标记物，利用特异性抗原抗体反应，在层析反应过程中，通过带颜色的胶体金颗粒来放大免疫反应系统，使反应结果在固相载体上直接显示出来。该技术操作简便、可靠性好、灵敏度高、反应迅速、结果直观并可大量制备，成本低廉，适合养殖场的大批量快速检测，真正实现了长期以来人们在检测
所追求的“快速、简便、特异、敏感”的目标。胶体金免疫层析技术已在猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒等多种动物病毒检测中得到应用，研究技术成熟，但现尚未见有将胶体金免疫层析技术用于石斑鱼神经坏死病毒抗体检测的相关报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对石斑鱼神经坏死病毒检测，提供了一种用于检测七带石斑鱼神经坏死病毒抗体的胶体金免疫层析检测试纸及其应用。本专利技术的检测试纸操作简便、灵敏度高、结果快速、成本低廉，适合养殖场开展七带石斑鱼神经坏死病毒抗体的快速诊断。为实现上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案予以实现：本专利技术提供了一种用于检测七带石斑鱼神经坏死病毒抗体的MCP重组蛋白的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3 所示。本专利技术还提供了一种用于检测七带石斑鱼神经坏死病毒抗体的胶体金免疫层析检测试纸，所述检测试纸包括有底座、衬板、试纸芯和覆盖于试纸芯上的面板，衬板连接在底座之上，所述试纸芯安装在衬板内，所述面板上设有加样孔和结果显示窗，所述试纸芯包括样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素反应膜和吸水垫，依次粘贴于衬板上；所述加样孔设于样品垫的上方位置，所述结果显示窗设于硝酸纤维素反应膜上方对应的位置，所述硝酸纤维素膜上设有检测线和对照线，检测线上包被有七带石斑鱼神经坏死病毒MCP重组蛋白，对照线上包被有鼠抗七带石斑鱼神经坏死病毒MCP蛋白单克隆抗体，所述的胶体金结合垫为包被有胶体金标记的七带石斑鱼MCP重组蛋白的玻璃纤维纸。进一步的：所述七带石斑鱼神经坏死病毒MCP重组蛋白的包被量为1.0 ~ 10μg蛋白，所述胶体金标记的七带石斑鱼MCP重组蛋白中胶体金标记量为1~20μg/mL，所述鼠抗七带石斑鱼神经坏死病毒MCP蛋白单克隆抗体的包被量为0.5 ~5.0μg 蛋白。进一步的：所述检测线和对照线两者线间距为5-7 mm。进一步的：所述的七带石斑鱼神经坏死病毒MCP重组蛋白采用以下方法制备得到：(1) 七带石斑鱼神经坏死病毒MCP蛋白重组表达质粒的构建以七带石斑鱼神经坏死病毒RNA 为模板，设计引物克隆得到编码七带石斑鱼神经坏死病毒MCP蛋白的cDNA 序列，将该序列插入表达载体，获得重组表达载体；(2) 七带石斑鱼神经坏死病毒MCP重组蛋白在大肠杆菌中的表达将重组表达载体转化大肠杆菌，挑选含重组表达载体的大肠杆菌接种到培养基中进行扩大培养，然后加入IPTG 诱导表达，收集细菌培养物；(3) 七带石斑鱼神经坏死病毒MCP重组包涵体蛋白的变复性收集包涵体，包涵体用缓冲液稀释后，装入透析袋中进行透析；(4) 七带石斑鱼神经坏死病毒MCP重组蛋白的Ni柱亲和纯化；将透析后的包涵体溶液上样至亲和层析柱进行蛋白纯化，收集蛋白流出液；将其装入透析袋中进行透析，获得纯化的MCP重组蛋白。进一步的：所述步骤(1) 中引物序列为：正向引物(F):Forward 5’-CCGGAATTCATGGTACGCAAAGGTGAGAAG-3’；反向引物(R)：Forward 5’-CCGCTCGAGGTTTTCCGAGTCAACCCTAGTG-3’。进一步的：所述步骤(2)中当细菌浓度生长到OD600=0.5~1.0时，按浓度0.5 ~ 0.7mmol/L 加入IPTG 诱导3 ~5h，离心，收集细菌培养物。进一步的：所述胶体金标记的七带石斑鱼神经坏死病毒MCP重组蛋白采用以下方法制备得到：采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液，取胶体金溶液和七带石斑鱼神经坏死病毒MCP重组蛋白，搅拌震荡使其结合，加入牛血清白蛋白，离心，弃上清，沉淀加入金标缓冲溶液悬浮后定容制得。本专利技术还提供了胶体金免疫层析检测试纸在制备用于检测七带石斑鱼神经坏死病毒抗体的检测用品中的应用。进一步的：在加样孔内加入稀释后的鱼类待检血清样本，静置后如果若检测线和对照线均呈现红色，表明待检血清样本中含有神经坏死病毒抗体；如果只有对照线呈现红色，表明检测样品中不含有神经坏死病毒抗体。与现有技术相比，本专利技术的优点和技术效果是：本专利技术提供的检测试纸包括有底座本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于检测七带石斑鱼神经坏死病毒抗体的MCP重组蛋白的编码基因，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NO：3 所示。
【技术特征摘要】
1.一种用于检测七带石斑鱼神经坏死病毒抗体的MCP重组蛋白的编码基因，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NO：3 所示。2.一种用于检测七带石斑鱼神经坏死病毒抗体的胶体金免疫层析检测试纸，其特征在于：所述检测试纸包括有底座、衬板、试纸芯和覆盖于试纸芯上的面板，衬板连接在底座之上，所述试纸芯安装在衬板内，所述面板上设有加样孔和结果显示窗，所述试纸芯包括样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素反应膜和吸水垫，依次粘贴于衬板上；所述加样孔设于样品垫的上方位置，所述结果显示窗设于硝酸纤维素反应膜上方对应的位置，所述硝酸纤维素膜上设有检测线和对照线，检测线上包被有七带石斑鱼神经坏死病毒MCP重组蛋白，对照线上包被有鼠抗七带石斑鱼神经坏死病毒MCP蛋白单克隆抗体，所述的胶体金结合垫为包被有胶体金标记的七带石斑鱼MCP重组蛋白的玻璃纤维纸。3.根据权利要求2所述的胶体金免疫层析检测试纸，其特征在于：所述七带石斑鱼神经坏死病毒MCP重组蛋白的包被量为1.0 ~ 10μg蛋白，所述胶体金标记的七带石斑鱼MCP重组蛋白中胶体金标记量为1~20μg/mL，所述鼠抗七带石斑鱼神经坏死病毒MCP蛋白单克隆抗体的包被量为0.5 ~5.0μg 蛋白。4.根据权利要求2 所述的胶体金免疫层析检测试纸，其特征在于：所述检测线和对照线两者线间距为5-7 mm。5.根据权利要求2 所述的胶体金免疫层析检测试纸，其特征在于：所述的七带石斑鱼神经坏死病毒MCP重组蛋白采用以下方法制备得到：(1) 七带石斑鱼神经坏死病毒MCP蛋白重组表达质粒的构建以七带石斑鱼神经坏死病毒RNA 为模板，设计引物克隆得到编码七带石斑鱼神经坏死病毒MCP蛋白的cDNA 序列，将该序列插入表达载体，获得重组表达载体；(2) 七带石斑鱼神经坏死病毒MCP重组蛋白在大肠杆菌中的表达将重组表达载体转化大肠杆菌，挑选含重组表达载体的大肠...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘滨，刘新富，孟振，柳学周，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院黄海水产研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。