一种鸭传染性浆膜炎灭活疫苗乳化方法技术

本发明专利技术公开了一种鸭传染性浆膜炎灭活疫苗乳化方法，包括以下步骤：水相制备：４份吐温－８０装入瓶中灭菌，冷却后加入９６份菌液，充分振摇，至吐温－８０完全溶解为止；油相制备：９３份注射用白油、５份司本－８０、２份硬脂酸铝，配油相时，先取少量注射用白油与硬脂酸铝混合，加热溶化，再与全量司本－８０及注射用白油混合均匀，搅拌至透明为止，１１６℃灭菌３０分钟，备用；将水相和油相按１∶１．５－１∶３的比例进行乳化，以３２００－４８００ｒ／ｍｉｎ的转速进行乳化，乳化时间８－１２分钟。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及兽用生物制剂
，特别涉及一种鸭传染性浆膜炎灭活疫苗乳化 方法。
技术介绍
鸭传染性浆膜炎又称为新鸭病、鸭败血症、鸭疫综合症、鸭疫巴氏杆菌病等，是由 鸭疫里默氏菌(Riemerella anatipestifer, RA)引起的一种接触性传染性疾病，多见于 1 8周龄的小鸭，尤以2 5周龄的雏鸭最为易感。潜伏期一般为2 5天，呈急性或慢 性败血症，临床上主要表现为眼、鼻分泌物增多、喘气、咳嗽、下痢、共济失调和头颈震颤，少 数慢性病例出现头颈歪斜等症状。病变以纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、脑膜炎及部分 病例出现关节炎为特征，常引起小鸭的大批发病和死亡。是目前对养鸭业危害最为严重的 细菌性传染病之一。在自然条件下，本病一年四季都有发生。主要通过污染的饲料、饮水、尘埃、飞沫 等，经呼吸道、消化道或皮肤的伤口(尤其是足蹼部皮肤)而感染。不同品种鸭如番鸭、半 番鸭、北京鸭、樱桃谷鸭、狄高鸭、金定鸭、麻鸭等均易感。它的发生与鸭龄的大小、感染菌株 的毒力强弱、饲养管理条件的好坏、各种不良应激因素或其它病原感染有一定的关系，死亡 率一般在5 % 75 %，在有其它疾病混合感染时，死亡率可高达90 %以上。耐过鸭常生长不 良，增重缓慢，失去饲养价值，而且该病在发病鸭场能持续存在，引起不同批次鸭的感染发 病，给养鸭业造成严重的经济损失。由于RA病给养鸭业带来严重的经济损失，有关其免疫预防研究引起了越来越多 的关注。尽管RA血清型较多，各型之间基本无交叉保护作用，给疫苗的研制带来了较大的 困难，但关于RA疫苗的研究，还是引起了兽用生物制品领域科研人员的广泛关注并认为鸭 疫里默氏菌预防的根本措施还是接种疫苗。目前研究报道的RA疫苗主要有RA灭活疫苗 (只有一种血清型的单价灭活疫苗、含多种血清型的多价灭活疫苗)、RA和E. coli 二联灭 活疫苗、RA弱毒活疫苗、提取获得RA亚单位成分的亚单位疫苗。其中灭活疫苗效果确实， 就目前研究进展来说是鸭疫里默氏菌预防最好的选择，但目前国内多是自家场疫苗(即自 己小量生产，自己使用)，鸭疫里默氏菌灭活苗的配方和乳化生产工艺没有正规的程序，但 灭活疫苗的配方和乳化过程对疫苗质量十分重要，它不仅对接种动物的安全有影响，对疫 苗的质量也有直接的影响，是鸭疫里氏杆菌灭活疫苗生产的基础和关键之一，目前未有用 于工厂化大规模发酵生产鸭疫里氏杆菌灭活疫苗的配方和乳化工艺的效果报道。。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供。本专利技术采用如下技术方案—种鸭传染性浆膜炎灭活疫苗乳化方法，包括以下步骤水相制备4份吐温-80 装入瓶中灭菌，冷却后加入96份菌液，充分振摇，至吐温-80完全溶解为止；油相制备93份注射用白油、5份司本_80、2份硬脂酸铝，配油相时，先取少量注射 用白油与硬脂酸铝混合，加热溶化，再与全量司本-80及注射用白油混合均勻，搅拌至透明 为止，116°C灭菌30分钟，备用；将水相和油相按1 1.5-1 3的比例进行乳化，乳化转速3200-4800r/min，乳化 时间8-12分钟。所述的鸭传染性浆膜炎灭活疫苗乳化方法，乳化时间为9 10分钟。所述的鸭传染性浆膜炎灭活疫苗乳化方法，水相和油相混合比例为1 2。所述的鸭传染性浆膜炎灭活疫苗乳化方法，乳化转速为4000r/min。采用本专利技术的乳化方法制备鸭传染性浆膜炎灭活疫苗为油包水型(W/0)，用清洁 吸管吸取少量疫苗滴于冷水中，呈油滴状不扩散，剂型合格率提高；疫苗在37°C左右条件 下放置21日，或取疫苗10ml装于离心管中以3000rpm/min离心15分钟，均不出现分层，稳 定性好；用1. 00ml吸管(出口内径1. 2mm)，吸取25°C左右的疫苗1. 00ml，令其垂直自然流 出，流出0. 4ml所需的时间均在8秒之内，粘度合格率高；外观为白色乳状液，色泽均勻，符 合要求。具体实施例方式以下结合具体实施例，对本专利技术进行详细说明。实施例11 %裂解血球全血N-J合成培养基制备配置100ml的裂解血球全血N-J合成培养基胰蛋白胨1.9g ；酵母提取物 0. 7g;牛肉浸膏0. 7g;水解乳蛋白0. 7g;葡萄糖0. 4g ；NaCl 0. 5g ；磷酸二氢钾0. 3g ； 磷酸氢二钾0. 3g ；Na2HP04 12H20 0. 9g ； (NH4)2S04 0. 2g ；NH4C1 0. 03g ；水加至 100mL ；将 上述各组分121°C灭菌15分钟，待灭菌成分冷却至低于40°C时，然后向上述基础培养基中 加入添加物裂解血球全血1ml ；摇勻后即得成品N-J合成培养基。所述添加物裂解血球全血为采用颈静脉采血或颈动脉放血的方法无菌采取非疫 区健壮牛血并无菌脱纤，于-20°C和室温冻融，反复冻融3次后，保存于-20°C备用或采血并 无菌脱纤后直接保存于-20°C，使用前取出反复冻融3次制得。实施例2鸭传染性浆膜炎灭活疫苗制苗菌液的制备1菌种血清I型鸭疫里默氏杆菌RA-CH-I株。2培养基 裂解血球全血N-J合成培养基、10%血清营养琼脂平板、裂解全血 及检验用培养基均严格按《中国兽药典》附录进行生产和检验合格后备用。3 方法3. 1 一级种子的繁殖与鉴定将冻干的血清I型鸭疫里默氏杆菌RA-CH-I株基础菌种接入5ml含10%犊牛血清 的营养肉汤中，37°C培养24小时；然后划线接种在2个含10%犊牛血清营养琼脂平板上， 按标准表面光滑、稍突起、圆形、呈奶油状的菌落，菌落直径1. 2 1. 7mm ；菌涂片可见到菌 体呈单个(偶见成对或呈丝状)，大小为0. 2 0. 4X 15 y m。选典型菌落接种含10%犊牛 血清营养琼脂斜面5支，置37°C，5-10% C02 (或者烛缸)环境下培养24小时，保存于4°C冰箱中(不超过7日)作为一级种子。3. 2 二级种子繁殖取一级种子3支，每支用2_3ml营养肉汤洗下，合并接种于350ml含10%犊牛血 清的营养肉汤，置37°C培养24小时，取样作纯粹检验合格后，保存于4°C冰箱中(不超过5 日)作为一级种子。3. 3制苗用菌液培养采用培养罐培养，在20L发酵罐中装入15L的N-J合成培养基及适量消沫剂，灭菌 后按培养基量的2%接种二级种子液300ml，同时按比例加入裂解血球全血150ml，于 37°C培养24小时。3. 4纯粹检验菌液培养完成后，取样用10%犊牛血清营养琼脂平板作纯粹检验，应纯粹。3. 5菌数测定将菌液定量取样离心后，用生理盐水连续离心洗涤3次并作适当稀释，于紫外 分光光度计下测定560nm处0D值，根据公式含菌总数(CFU/ml) = OD560nm值X稀释倍 数X 2 X 109CFU/ml计算出菌液含菌量，每1. 00ml含活菌不低于3. 00 X 1010CFU,计数结果作 为配苗时参考。4 结果取发酵菌液1ml，以3000 5000转/分钟离心5_10分钟后，用生理盐水连续 离心(3000 5000转/分钟，5-10分钟)洗涤3次；用生理盐水50ml溶解和稀释沉淀 (即50倍稀释)；于紫外分光光度计下测定560nm处0D值(用生理盐水调0)，测得OD560nm 为0. 589 ；根据公式含菌总数(CFU/ml) = OD560nm值X稀本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鸭传染性浆膜炎灭活疫苗乳化方法，其特征在于，包括以下步骤：水相制备：４份吐温－８０装入瓶中灭菌，冷却后加入９６份菌液，充分振摇，至吐温－８０完全溶解为止；油相制备：９３份注射用白油，５份司本－８０，２份硬脂酸铝，配油相时，先取少量注射用白油与硬脂酸铝混合，加热溶化，再与全量司本－８０及注射用白油混合均匀，搅拌至透明为止，１１６℃灭菌３０分钟，备用；将水相和油相按１∶１．５－１∶３的比例进行乳化，乳化转速３２００－４８００ｒ／ｍｉｎ，乳化时间８－１２分钟。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：程安春，汪铭书，朱德康，陈孝跃，
申请(专利权)人：四川农业大学实验动物工程技术中心，
类型：发明
国别省市：51[中国|四川]