本发明专利技术公开了一种快速检测猪2型圆环病毒的实时荧光RPA试剂盒及其用途，还公开了一种快速检测猪2型圆环病毒的试纸条RPA试剂盒及其用途。该两种试剂盒分别包括SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.2所示的引物及各自的探针，虽然针对同一靶标序列，但引物和探针的修饰碱基和检测平台不同。实验证明本发明专利技术的两个试剂盒的敏感性均为102拷贝/反应，并均只能特异性检测猪2型圆环病毒。分别用本发明专利技术的两个试剂盒检测猪2型圆环病毒疑似样品，结果表明这两个试剂盒的检测结果与qPCR的符合度均为100％。因此，本发明专利技术的两个试剂盒均能快捷、高效、灵敏的检测猪2型圆环病毒，为猪2型圆环病毒的鉴别诊断提供了有效技术手段。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种检测猪2型圆环病毒的试剂盒及其用途，特别涉及一种基于RPA反应的用于快速检测猪2型圆环病毒的实时荧光RPA试剂盒以及试纸条RPA试剂盒，还涉及二者在快速检测猪2型圆环病毒中的用途，本专利技术属于预防兽医学检验领域。
技术介绍
自PCR技术诞生以来已经有三十年了。从经典PCR、实时定量PCR再到现在的数字PCR，这一技术在不断蜕变却从未淡出我们的视野。但是该技术需要特殊昂贵的热循环仪器以及熟练的操作人员，费时费力，难以用在现场诊断以及实验条件差的地方。在发展中国家实验室中，由于PCR实施所需要的基础设备和技术所限，大多数发展中国家仍然集中在使用传统的试验方法，比如血清学方法、显微镜技术，或者培养以及鉴定传染性以及非传染性疾病。为了填补传统方法和PCR之间的空缺，新的等温分子诊断技术正在开发，该方法尤其适用于基础设施、实验设备以及试验技术难于支持使用PCR进行诊断的地方。与常规方法相比较，等温扩增实验具有很高的敏感性和特异性，这些原因促使不同的公司商业化不同的等温扩增技术，比如，环介导的扩增(LAMP；Eiken,日本)，RPA(RPA；Alere,USAandTwistDx,UK)，链置换扩增(stranddisplacementamplification,BectonDickson,USA)。在这些技术中，LAMP是使用最为广泛，且最成熟的试验方法。与RPA方法相比较，LAMP技术具有试验设计比较麻烦(3对引物)，特异性相对较弱(能扩增很多条带)，时间仍然相对较长，以及易于污染等不足的地方。英国TwistDxInc公司开发的重组酶聚合酶扩增(RecombinasePolymeraseAmplification，RPA)被称为是可以替代PCR的核酸检测技术。以此为基础的核酸扩增产品能够在15分钟内，37℃-42℃之间进行核酸检测。现在使用最多的、最为成熟的为进行实时监控的体系(如exo试剂盒，real-timeRPA)以及基于试纸条的终点检测(nfo试剂盒，RecombinasePolymeraseAmplificationAssaycombinedwithlateralflowtest，LFSRPA)。实时荧光RPA(real-timeRPA)试验需要能激发并检测荧光基团的恒温仪器，比如酶标仪或实时检测的热循环仪。自开发以来，该技术已经被广泛的应用到人类疾病、兽医药物、食品工业以及农业中，比如用于土拉弗朗西斯菌、细螺旋体、HIV-1DNA、鼠疫杆菌、炭疽杆菌、天花病毒、B型链球菌、大肠杆菌产生的志贺毒素、中东呼吸综合征冠状病毒、裂谷热病毒、口蹄疫病毒、牛冠状病毒、埃博拉病毒、苏丹病毒、马尔堡病毒、施马伦贝格病毒、牛病毒性腹泻病毒、黄热病毒以及戈登病毒等病原的检测。对于试纸条RPA(LFSRPA)试验而言，只要温度能控制在37-42℃之间就行，比如可以在水浴锅等设置中进行反应，或者直接用人的体温进行加热，随后可以通过侧流层析试纸条LFS(Hybridetect2T，MileniaBiotecGmbH,Germany)读取试验结果。自开发以来，该技术已经被广泛的应用到人类疾病、兽医药物、食品工业以及农业中，比如用于感染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)、恶性疟原虫、洋李痘疱病毒、羌虫、力克次体、隐孢子虫以及黄热病毒等的检测。与常规方法相比较，该实验具有很高的敏感性和特异性。猪圆环病毒(Porcinecircovirus，PCV)属于圆环病毒科，圆环病毒属的成员，PCV是小的、无囊膜的DNA病毒，直径大约为17纳米。根据DNA序列、抗原性以及致病性可将其分为两个不同的基因型—PCV1和PCV2。PCV1被认为不具有致病性，并且在猪肾细胞系(PK-15)中持续感染。可是，PCV2断奶仔猪多系统衰竭综合症(PMWS)的主要病原，表现为免疫系统损失，淋巴细胞减少、淋巴结肿大等病变，同时引发其他病原的继发感染，目前已成为严重阻碍养猪业发展的主要病原之一。进一步来说，PCV2是一种免疫抑制病毒，感染该病毒的猪更容易被其他病毒或者细菌感染。调查显示，PCV2在猪体内广泛存在。因此，建立一种快速、简单、特异、敏感的检测方法来检测PCV2对于该病的防控起着关键的作用。Zhou等(Zhou,S.,etal.,Loop-mediatedisothermalamplificationfordetectionofporcinecircovirustype2.VirolJ,2011.8:p.497.)公开了一种检测猪2型圆环病毒的环介导等温扩增法。通过LAMP的扩增结果表明，该方法能够出现很多扩增条带，因此该方法存在非特异性扩增，而且该方法需要设计三对引物来进行扩增，因此增加了实验设计的难度，并且增加了其与其他检测平台相结合的难度。并且检测温度较高(63℃)，检测时间较长(60min)。并且需要核酸电泳对扩增产物进行检测，增加了污染的可能性。Yang等(Yang,Z.Z.,etal.,DetectionofPCV2DNAbySYBRGreenI-basedquantitativePCR.JZhejiangUnivSciB,2007.8(3):p.162-9.)公开了一种基于SYBRgreenI的用于检测PCV2DNA的实时荧光定量PCR法。该方法需要复杂的试验设备以及熟练的操作人员，该方法需要较长的试验时间(大约1.5h)。由于SYBRGreenI非特异性结合所有的双链DNA，因此，该方法的特异性相对较差。本专利技术针对猪2型圆环病毒的ORF2基因，建立并评估了基于荧光探针的RPA(real-timeRPA)检测试剂盒以及基于试纸条的LFSRPA检测试剂盒以实现快速检测猪2型圆环病毒的目的，据我们所知，国内外尚无建立这样的试剂盒用于检测猪2型圆环病毒。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种能快速、简单、特异的鉴定猪2型圆环病毒的检测方法及试剂盒。为了达到上述目的，本专利技术采用了以下技术手段：本专利技术专利技术人针对猪2型圆环病毒的ORF2基因设计引物和探针。同时通过对来自于GenBank中的KR559725.1、KR559695.1、KM455975.1、KP768481.1、JN181905.1、JN181902.1、KF850461.1、KC620515.1、KF035059.1、KF951567.1、KF951570.1、KM624031.1和JQ002672.1的ORF2基因同源序列进行比对分析，进一步确定了猪2型圆环病毒ORF2基因的保守区域，针对该区域设计引物和探针，以期能够检测到尽可能本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于快速检测猪2型圆环病毒的实时荧光RPA检测试剂盒，其特征在于包括有一对引物和一条探针，其中，所述的一对引物和一条探针的序列如下所示：上游引物：5’‑AAACCTGTCCTAGATTCCACTATTGATTACTTCCA‑3’下游引物：5’‑TTGTATTCCTGGTCGTATATACTGTTTTCGAACGC‑3’探针：5’‑ATTACTTCCAACCAAACAACAAAAGAAATCAGCTG‑FAM‑dT‑G‑THF‑C‑BHQ1‑dT‑GAGACTACAAACTGC‑P‑3’。
【技术特征摘要】
1.一种用于快速检测猪2型圆环病毒的实时荧光RPA检测试剂盒，其特征在于包括有一
对引物和一条探针，
其中，所述的一对引物和一条探针的序列如下所示：
上游引物：5’-AAACCTGTCCTAGATTCCACTATTGATTACTTCCA-3’
下游引物：5’-TTGTATTCCTGGTCGTATATACTGTTTTCGAACGC-3’
探针：5’-ATTACTTCCAACCAAACAACAAAAGAAATCAGCTG
-FAM-dT-G-THF-C-BHQ1-dT-GAGACTACAAACTGC-P-3’。
2.如权利要求1所述的实时荧光RPA检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒中还包括水解
缓冲液，醋酸镁以及ddH2O。
3.如权利要求1或2所述的实时荧光RPA检测试剂盒，其特征在于用于检测猪2型圆环病
毒时，反应体系如下：14.75μL的水解缓冲液，1.05μL的10μM上游引物，1.05μL的10μM下游引
物，0.075μL的10μM探针，2μL的病毒DNA模板，4.825μL的ddH2O以及1.25μL的280mM醋酸镁；
扩增反应在温度设定为37-39℃的实时荧光定量PCR仪中进行，反应时间为20min-1h，
结束后通过Mx3005P软件对结果进行分析。
4.如权利要求3所述的实时荧光RPA检测试剂盒，其特征在于扩增反应在温度设定为37
℃的实时荧光定量PCR仪中进行，反应时间为20min，结束后通过Mx3005P软件对结果进行分
析。
5.权利要求1-4任一项所述的实时荧光RPA检测试剂盒在制备检测猪2型圆环病毒试剂<...
【专利技术属性】
技术研发人员：张志东，杨洋，秦晓东，孙英军，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃;62
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