一种快速检测黄瓜绿斑驳花叶病毒的试纸条制造技术

本发明专利技术公开了一种检测黄瓜绿斑驳花叶病毒（CGMMV）的免疫胶体金试纸条及其制备方法。将纯化的CGMMV多克隆抗体溶液点在硝酸纤维素膜的检测线上，羊抗兔多克隆抗体点在硝酸纤维素膜的质控线上；分别将吸水滤纸制成的样品垫、CGMMV免疫胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水纸依次贴到一张带不干胶的PVC胶板上，制成试纸条。本发明专利技术的试纸条可检测出葫芦科植物中的CGMMV，适用于由CGMMV引起的病毒病检测和诊断。该方法简便、快速、成本低廉，5-10分钟即出结果，便可肉眼直接观察。适用于基层各级农业部门、农户和出入境检验部门开展病害的快速大量筛选检测，有助于及时有效的控制和扑灭疫情，具有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种检测黄瓜绿斑驳花叶病毒（CGMMV）的免疫胶体金试纸条及其制备方法。将纯化的CGMMV多克隆抗体溶液点在硝酸纤维素膜的检测线上，羊抗兔多克隆抗体点在硝酸纤维素膜的质控线上；分别将吸水滤纸制成的样品垫、CGMMV免疫胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水纸依次贴到一张带不干胶的PVC胶板上，制成试纸条。本专利技术的试纸条可检测出葫芦科植物中的CGMMV，适用于由CGMMV引起的病毒病检测和诊断。该方法简便、快速、成本低廉，5-10分钟即出结果，便可肉眼直接观察。适用于基层各级农业部门、农户和出入境检验部门开展病害的快速大量筛选检测，有助于及时有效的控制和扑灭疫情，具有广阔的应用前景。【专利说明】一种快速检测黄瓜绿斑驳花叶病毒的试纸条
本专利技术涉及一种植物中黄瓜绿斑驳花叶病毒的检测试纸条及制备方法，特别是一种检测葫芦科中黄瓜绿斑驳花叶病毒的免疫胶体金试纸条及制备方法。
技术介绍
黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumbergreen mottle mosaic virus, CGMMV)属于完菁花叶病毒科iTymoviridae)烟草花叶病毒属(TbAaffiorirw1S),是葫芦科的重要病毒之一，主要侵染黄瓜、西瓜、甜瓜、葫芦、南瓜等葫芦科植物。该病毒于1935年在英国的黄瓜上被首次发现，随后在希腊、以色列、法国、印度、日本、韩国、印度尼西亚和巴基斯坦均有发生，对葫芦科作物的生产造成严重的经济损失。CGMMV在我国的发生相对较晚，1987年在台湾的冬瓜、西瓜、甜瓜和黄瓜上分离鉴定出该病毒，2003年报道在广西观赏南瓜发生。2005年在辽中地区发现该病毒在西瓜上大面积发生，是中国大陆地区首次在大田上发生该病毒的报道，给该地区的西瓜造成严重的损失。目前，CGMMV在我国台湾、辽宁、广西、河北、北京、山东、甘肃、湖北、云南、四川、广东、浙江、湖南等省市多个地区发现，可经种子、汁液、病株残体，以及被污染的土壤、水体、啮齿动物粪便、菟丝子等多种方式传播，给葫芦科作物的生产造成严重威胁，已列入我国新修订的禁止进境有害生物名录。近年来厦门出入境检验检疫局曾多次从进境的南瓜种子检出该病毒。植物病毒诊断鉴定方法主要包括指示植物法、电子显微镜法、血清学法和分子生物学法等。由于CGMMV的寄主范围、粒体形态与大小等特性很难与同类病毒相区分，症状多样并常有隐症现象，株系多、血清型多给常规诊断带来困难。CGMMV可通过接种以苋色藜、蔓陀罗、矮牵牛等指示植物来鉴定，但与同属其他病毒表现的症状十分相似，而且不同的病毒株系产生不同的症状，因而可靠性不高，且检测周期长。电子显微镜可观察受侵染细胞的结构变化以及病毒粒体的形态和大小，但设备要求高、前处理复杂，通常只能起辅助鉴定的作用。分子生物学检测法具有灵敏、快速、特异性强等优点，但由于CGMMV为RNA病毒，RNA容易降解，提取和操作过程对于环境和技术要求较高，需要昂贵的试剂和特殊的设备，只能在实验室内进行，不利于普及。血清学方法多适用于大量样品的检测，不能实现单一样品检测，且需要专门的仪器设备和专业的技术操作人员，操作过程也相对复杂，检测时间要4-12小时不等，不利于推广。
技术实现思路
本专利技术的目的是解决上述存在诸如检测时间长、不能现场检测、检测费用高等不足，提供一种特异性强、敏感性高、简易快速、费用低廉、能现场检测的适用于黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)的胶体金免疫层析试纸条及其制备方法。本专利技术提供的技术方案为:一种快速检测黄瓜绿斑驳花叶病毒CGMMV的试纸条，由标记好质控线和检测线的硝酸纤维素膜、样品垫、免疫胶体金垫、吸水纸和PVC胶板构成，依次将样品垫、免疫胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水纸贴到一张带不干胶的PVC胶板上，确保接头处有叠压，使层析能顺利进行；其中所述的质控线的成分是羊抗兔多克隆抗体，检测线的成分是纯化的CGMMV多克隆抗体；所述的免疫胶体金垫是载有胶体金标记的CGMMV多克隆抗体的玻璃纤维；所述的CGMMV多克隆抗体是CGMMV外壳蛋白经原核可溶表达、并纯化浓缩后注射大耳白兔获得的CGMMV多克隆抗体。具体的制备方法包括如下步骤: (1)CGMMV多克隆抗体的制备:通过同源克隆方法获得CGMMV外壳蛋白基因，构建CGMMV-pET32aCP原核表达载体，转化大肠杆菌BL21 (DE3) pLysS菌株，在0.1 mmol/L的IPTG终浓度、23 °C恒温、90 rpm摇床转速下诱导25小时，获得CGMMV-CP外源融合蛋白的可溶表达，将表达上清用Ni琼脂糖凝胶FF柱纯化，经超滤离心管离心浓缩目的蛋白，以纯化蛋白为抗原注射大耳白兔，采血，取血清，提纯抗体IgG，纯度不小于95% ; (2)胶体金制备:将100mL 0.01%氯化金用2_3 mL的1%柠檬三钠还原成15 nm-60nm的颗粒溶液； (3)CGMMV免疫胶体金溶液制备:用0.1 mo I/L K2CO3将胶体金溶液pH值调至7-8.5，将胶体金溶液按100 mL胶体金溶液中加入0.5 mg-2 mg步骤(I)的CGMMV多克隆抗体，混合均匀，再加入10%BSA至终浓度0.5-2%进行封闭，12000rpm离心20min，去上清，取沉淀即获得CGMMV免疫胶体金溶液。(4)将上述的CGMMV免疫胶体金溶液用PBS缓冲液进行稀释到工作浓度，并加入5-25%蔗糖，混匀后用喷金机喷涂到聚酯膜或玻璃纤维标记垫介质上，形成CGMMV免疫胶体金垫； (5)将CGMMV多克隆抗体用0.0lM的PBS溶液进行稀释到工作浓度，加入2%的蔗糖，用划膜机点在硝酸纤维素膜检测线上，羊抗兔多克隆抗体点在硝酸纤维素膜质控线上； (6)将吸水滤纸制成的样品垫、CGMMV免疫胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水纸依次贴到一张带不干胶的PVC胶板上，并贴上带有插入液体面最高限位的指示线MAX的胶带，然后切割成试纸条； (7)将组装好的试纸条密封包装保存。制备出来的试纸条示意图见图1。本专利技术的有益效果是，本专利技术所用的免疫抗原为原核表达抗原，是针对CGMMV外壳蛋白设计并表达纯化的抗原，其免疫原性高，所制备的抗体能特异识别CGMMV外壳蛋白，从而提高了检测的灵敏度和准确性；用本专利技术检测葫芦科CGMMV病毒，检测时间短，成本低廉，检测灵敏度可以达到10ng/ml,与WMV:西瓜花叶病毒(Watermelon mosaic virus)；ZYMV:小西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus) ;TMV:烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus);CMV:黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus);SqMV:南瓜花叶病毒(Squash mosaic virus)不交叉。本专利技术适用于基层各级农业部门、农户和出入境检验部门开展病害的快速大量筛选检测，有助于及时有效的控制和扑灭疫情，具有广阔的应用前景。【专利附图】【附图说明】图1.本专利技术示意图； 1.表示吸水滤纸制成的样品垫，2.CGMMV免疫胶体金垫，3.硝酸纤维素膜， 4.吸水纸，5.PVC胶板，6.CGMMV多克隆抗体点在检测线，7.羊抗兔多克隆抗体点在质控线。图2.试纸条的样板图。图3.试纸条检本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速检测黄瓜绿斑驳花叶病毒CGMMV的试纸条，由标记好质控线和检测线的硝酸纤维素膜、样品垫、免疫胶体金垫、吸水纸和PVC胶板构成，依次将样品垫、免疫胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水纸贴到一张带不干胶的PVC胶板上，确保接头处有叠压，使层析能顺利进行；其中所述的质控线的成分是羊抗兔多克隆抗体，检测线的成分是纯化的CGMMV多克隆抗体；所述的免疫胶体金垫是载有胶体金标记的CGMMV多克隆抗体的玻璃纤维；所述的CGMMV多克隆抗体是CGMMV外壳蛋白经原核可溶表达、并纯化浓缩后注射大耳白兔获得的CGMMV多克隆抗体。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：范国成，林雄杰，林志铿，胡菡青，陈庆河，翁启勇，
申请(专利权)人：福建省农业科学院果树研究所，
类型：发明
国别省市：