一种豇豆花叶病毒亚科病毒广谱检测试剂盒及其方法技术

本发明专利技术公开了一种豇豆花叶病毒亚科病毒广谱检测试剂盒及其检测方法。本发明专利技术所提供的豇豆花叶病毒亚科病毒广谱检测试剂盒中含有由三条引物组成的成套引物。实验证明，本发明专利技术所提供的用于检测豇豆花叶病毒亚科病毒的成套引物及其试剂盒具有广谱性好、灵敏度高、特异性强、检测周期短等特点，适用于农业生产及进出境口岸上豇豆花叶病毒亚科病毒的快速检测与监测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于植物检疫
，涉及一种豇豆花叶病毒亚科病毒广谱检测试剂盒及其检测方法，特别涉及用于豇豆花叶病毒亚科病毒的成套引物、试剂盒及其检测方法。
技术介绍
豇豆花叶病毒亚科(Comovirinae)属于小RNA病毒目(Picornavirales)、伴生豇豆病毒科(Secoviridae)，含有豇豆花叶病毒属(Comovirus)、蚕豆病毒属(Fabavirus)和线虫传多面体病毒属(Nepovirus)，分别含有15种、5种和36种病毒。在豇豆花叶病毒属病毒中，有11种病毒的寄主范围比较窄，仅侵染豆科植物，而其他种类则侵染茄科、十字花科、葫芦科等植物。豇豆花叶病毒属病毒主要引起花叶、斑驳症状，通常不会引起环斑症状。蚕豆病毒属病毒具有非常广的寄主范围，包括双子叶植物，以及一些科的单子叶植物。蚕豆病毒属病毒引起的症状包括环斑、斑驳、花叶、畸型、萎蔫和顶端坏死。线虫传多面体病毒属病毒的寄主因病毒而异，有宽有窄，广泛分布于温带地区。环斑是线虫传多面体病毒属病毒侵染的典型症状，但通常伴随斑驳和斑点症状。豇豆花叶病毒属病毒只通过甲虫传播，特别是叶甲科的种类。蚕豆病毒属病毒则通过蚜虫传播。线虫传多面体病毒属中的12种病毒通过长针线虫传播，3种通过花粉传播，1种通过螨虫传播，而其它病毒种类的传播介体还未知。该亚科病毒中，近一半的病毒种类还可以通过种子传播。豇豆花叶病毒亚科中的多种病毒成员具有十分重要的经济重要性，对农业生产安全和生态安全造成巨大的威胁。该亚科病毒中，有8种病毒被我国列为禁止进境的检疫性有害生物，包括：南芥菜花叶病毒(Arabis mosaic virus,ArMV)、菜豆荚斑驳病毒(Bean pod mottle virus,BPMV)、蚕豆染色病毒(Broad bean stain virus,BBSV)、豇豆重花叶病毒(Cowpea severe mosaic virus,CPSMV)、桃丛簇花叶病毒(Peach rosette mosaic virus,PRMV)、烟草环斑病毒(Tobacco ringspot virus,TRSV)、番茄环斑病毒(Tomato black ring virus,TBRV)、番茄黑斑病毒(Tomato ringspot virus,ToRSV)。此外，还有一半还多的病毒种类在我国尚未报道发生。目前，在豇豆花叶病毒亚科病毒日常检测中，快速的检测方法普遍使用血清学和分子生物学方法，特别是酶联免疫吸附试验(ELISA)方法和反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法。其中，ELISA检测需要特异的抗体，通常都是由专业的试剂公司提供。目前，国内外检测试剂公司提供的豇豆花叶病毒亚科病毒检测抗体种类还十分有限，只局限于其中几种病毒。RT-PCR方法是豇豆花叶病毒亚科病毒检测中使用非常广泛的另外一种快速检测方法。目前，国内外只是建立其中几种密切关注的病毒种类，有些病毒种类甚至还未知其基因组序列。因此，在豇豆花叶病毒亚科病毒中，多数的病毒种类没有相应的血清学，也没有快速的分子检测方法。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种检测或辅助检测豇豆花叶病毒亚科病毒的成套引物。本专利技术提供的检测或辅助检测豇豆花叶病毒亚科病毒的成套引物为如下1)或2)：1)由引物1、引物2和引物3组成；2)由引物1、引物2、引物4和引物5组成；所述引物1为序列1所示的单链DNA分子；所述引物2为序列2所示的单链DNA分子；所述引物3为序列3所示的单链DNA分子；所述引物4为序列4所示的单链DNA分子；所述引物5为序列5所示的单链DNA分子。本专利技术的第二个目的是提供一种检测或辅助检测豇豆花叶病毒亚科病毒的PCR试剂。本专利技术提供的检测或辅助检测豇豆花叶病毒亚科病毒的PCR试剂包括上述成套引物。上述PCR试剂中，所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4和所述引物5在所述PCR试剂中的终浓度均为10μmol/L。本专利技术所提供的检测或辅助检测豇豆花叶病毒亚科病毒的PCR试剂，具体可包括所述成套引物，以及M-MLV反转录酶、5×M-MLV缓冲液、dNTPs、RNA酶抑制剂、10×Taq DNA聚合酶缓冲液(含Mg2+)和Taq DNA聚合酶。本专利技术的第三个目的是提供一种检测或辅助检测豇豆花叶病毒亚科病毒的试剂盒。本专利技术提供的检测或辅助检测豇豆花叶病毒亚科病毒的试剂盒包括上述成套引物或上述PCR试剂。本专利技术所提供的检测或辅助检测豇豆花叶病毒亚科病毒的试剂盒，具体可含有所述成套引物或所述PCR试剂，以及作为阳性对照的豇豆花叶病毒亚科病毒的病叶冻干粉末(如含有豇豆花叶病毒的叶片冻干粉末)；和/或作为阴性对照的水。本专利技术的第四个目的是提供上述成套引物或上述PCR试剂或上述试剂盒的新用途。本专利技术提供了上述成套引物或上述PCR试剂或上述试剂盒在检测或辅助检测待测病毒是否为豇豆花叶病毒亚科病毒中的应用。本专利技术还提供了上述成套引物或上述PCR试剂或上述试剂盒在制备检测或辅助检测待测病毒是否为豇豆花叶病毒亚科病毒的产品中的应用。本专利技术还提供了上述成套引物或上述PCR试剂或上述试剂盒在检测或辅助检测待测样品中是否含有豇豆花叶病毒亚科病毒中的应用。本专利技术还提供了上述成套引物或上述PCR试剂或上述试剂盒在制备检测或辅助检测待测样品中是否含有豇豆花叶病毒亚科病毒的产品中的应用。本专利技术的五个目的是提供一种检测或辅助检测待测样品中是否含有豇豆花叶病毒亚科病毒的方法。本专利技术提供的检测或辅助检测待测样品中是否含有豇豆花叶病毒亚科病毒的方法包括如下步骤：(1)从所述待测样品中提取总RNA，采用上述引物1进行反转录反应，得到待测cDNA；(2)以所述待测cDNA作为模板，采用上述引物1和上述引物2进行第一轮PCR反应，获得第一轮PCR产物；(3)以第一轮PCR产物作为模板，采用上述引物1和上述引物3进行第二轮PCR反应，获得第二轮PCR产物；或以第一轮PCR产物作为模板，采用上述引物4和上述引物5进行第二轮PCR反应，获得第二轮PCR产物；(4)根据所述第二轮PCR产物的大小按照如下方法确定所述待测样品中是否含有豇豆花叶病毒亚科病毒：若所述第二轮PCR产物中含有大小为400～440bp的DNA片段，则所述待测样品中含有或候选含有豇豆花叶病毒亚科病毒，反之则所述待测样品中不含有或候选不含有豇豆花叶病毒亚科病毒。上述方法中，所述反转录反应的温度为42℃。上述方法中，所述第一轮PCR反应共进行35个循环，前5个循环的退火温度为42℃，后30个循环的退火温度为50℃。上述方法中，所述第二轮PCR反应共进行40个循环，前5个循环的退火温度为42℃，后35个循环的的退火温度为52℃。在本专利技术中，以上所有的所述待测样品均可为植物样品，如感染了豇豆花叶病毒亚科病毒的植物叶片。在本专利技术中，以上所有的所述豇豆花叶病毒亚科病毒均可为如下中的任一种或多种：爱琴海菊芋环斑病毒、安弟斯马铃薯斑驳病毒、安那托利亚葡萄环斑病毒、澳洲紫花苜蓿潜隐病毒、保加利亚葡萄潜隐病毒、菜豆粗缩花叶病毒、菜豆荚斑驳病毒、蚕豆染色病毒、蚕豆萎蔫病毒1号、蚕豆萎蔫病毒2号、蚕豆真花叶病毒、鹑豌豆花叶病毒、大豆属花叶病毒、滇芎A病毒、番茄黑环病毒、番茄环斑病毒、广藿香轻型花叶病本文档来自技高网...

【技术保护点】
检测或辅助检测豇豆花叶病毒亚科病毒的成套引物，为如下1)或2)：1)由引物1、引物2和引物3组成；2)由引物1、引物2、引物4和引物5组成；所述引物1为序列1所示的单链DNA分子；所述引物2为序列2所示的单链DNA分子；所述引物3为序列3所示的单链DNA分子；所述引物4为序列4所示的单链DNA分子；所述引物5为序列5所示的单链DNA分子。

【技术特征摘要】
1.检测或辅助检测豇豆花叶病毒亚科病毒的成套引物，为如下1)或2)：1)由引物1、引物2和引物3组成；2)由引物1、引物2、引物4和引物5组成；所述引物1为序列1所示的单链DNA分子；所述引物2为序列2所示的单链DNA分子；所述引物3为序列3所示的单链DNA分子；所述引物4为序列4所示的单链DNA分子；所述引物5为序列5所示的单链DNA分子。2.一种检测或辅助检测豇豆花叶病毒亚科病毒的PCR试剂，包括权利要求1所述的成套引物。3.根据权利要求2所述的PCR试剂，其特征在于：所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4和所述引物5在所述PCR试剂中的终浓度均为10μmol/L。4.一种检测或辅助检测豇豆花叶病毒亚科病毒的试剂盒，包括权利要求1所述的成套引物或权利要求2或3所述的PCR试剂。5.权利要求1所述的成套引物或权利要求2或3所述的PCR试剂或权利要求4所述的试剂盒在检测或辅助检测待测病毒是否为豇豆花叶病毒亚科病毒中的应用；或权利要求1所述的成套引物或权利要求2或3所述的PCR试剂或权利要求4所述的试剂盒在制备检测或辅助检测待测病毒是否为豇豆花叶病毒亚科病毒的产品中的应用。6.权利要求1所述的成套引物或权利要求2或3所述的PCR试剂或权利要求4所述的试剂盒在检测或辅助检测待测样品中是否含有豇豆花叶病毒亚科病毒中的应用；或权利要求1所述的成套引物或权利要求2或3所述的PCR试剂或权利要求4所述的试剂...

【专利技术属性】
技术研发人员：廖富荣，沈建国，黄蓬英，方志鹏，林振基，
申请(专利权)人：厦门出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：福建;35