本发明专利技术公开一种柑橘衰退病毒与柑橘裂皮病毒双重检测试剂盒及其应用。本发明专利技术设计了柑橘衰退病毒与柑橘裂皮病毒的双重数字PCR定量检测试剂组合物。该试剂盒包含：病样RNA提取试剂、cDNA反转录合成试剂、数字PCR反应试剂、柑橘衰退病与柑橘裂皮病阳性对照样品模板和阴性对照样品模板。应用本发明专利技术试剂盒检测柑橘衰退病毒与柑橘裂皮病毒具有特异性强、抗杂质干扰更好、简便快速、检测灵敏度与现有的实时荧光定量PCR检测方法相当等优点，可用于柑橘衰退病毒与柑橘裂皮病毒的早期定性、定量检测以及流行病学调查等。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于植物病害检测
，具体涉及一种柑橘衰退病毒与柑橘裂皮病毒双重数字PCR定量检测试剂盒及其应用。技术背景柑橘衰退病和柑橘裂皮病是柑橘上的两种重要病毒病害。柑橘衰退病毒是长线形病毒属的正义单链RNA病毒；该病毒主要通过蚜虫和带病接穗进行传播，目前已经毁灭超过１亿株柑橘，对柑橘产业造成巨大危害。柑橘裂皮病毒为马铃薯纺缍块茎类病毒属，是一种低分子量的共价闭合环状RNA病毒，不具有蛋白质外壳, 也不具备规则的几何结构；该病毒可通过嫁接或修剪用的工具机械传播，引起砧木部树皮纵裂，导致树势衰弱、植株矮化和严重减产。近年来，柑橘衰退病和柑橘裂皮病在我国柑橘产区的发病率不断上升，二者复合侵染的情况越来越多，针对此二种病害建立快速定量检测方法有助于掌握其在我国的流行趋势和危害程度，及时发出病害预警，从而为我国柑橘产业的健康、持续发展提供保障。针对柑橘衰退病和柑橘裂皮病的检测，目前已有核酸杂交和血清学检测的方法，但都非常耗时和繁琐。普通RT-PCR、实时荧光定量PCR也可用于此二种病害的检测，但普通RT-PCR检测灵敏度不足，而实时荧光定量PCR方法在定量分析时，需要依赖标准物质和标准曲线，仅能实现相对定量分析。另外，实时荧光定量PCR对反应扩增效率要求很高，且易受模板纯度和PCR抑制因子等因素的影响，导致对目标序列定量的不准确估计。此外，基于实时荧光定量PCR的复合多靶标体系的优化非常困难，定量分析通量较低；因此，实时荧光定量PCR已不能完全满足柑橘衰退病毒和柑橘裂皮病毒的高灵敏度定量检测需求。本专利技术开发了一套柑橘衰退病毒与柑橘裂皮病毒双重数字PCR定量检测方法，与现有方法相比，本专利技术的柑橘衰退病毒与柑橘裂皮病毒双重数字PCR定量检测方法具有如下几个方面的优点。1.简便可靠的绝对定量：本专利技术所使用的柑橘衰退病毒与柑橘裂皮病毒双重数字PCR定量检测方法采用了数字检测芯片系统，其数字PCR的检测芯片微孔数远大于样品中病毒的靶标拷贝数，该方法通过样品极限稀释、泊松分布和终点法PCR，来实现核酸的绝对定量，因此本方法的靶标定量检测不依赖于扩增曲线的阈值，不受PCR扩增效率的影响，也不需建立标准曲线，不需进行复杂的转化运算，因此更加简便的实现绝对定量分析，并具有更好的检测准确度和重现性。2.抗杂质干扰能力强，检测灵敏度高：本方法的数字PCR检测方法，可将每个样品分成20,000多个均匀的纳升级微滴，其中每个微滴都作为一个独立的PCR反应器，这种方法可在很大程度上把柑橘中的杂质及柑橘cDNA与病毒靶标隔离开，极大的减少了其他物质的干扰，由于该技术使每一出现阳性荧光的微孔对应一个病毒靶标拷贝，因此即使检测体系中仅有一个靶标拷贝也可以很好的检出。3.高特异性：本专利技术根据柑橘衰退病毒与柑橘裂皮病毒的特有序列设计了特异性引物和特异探针，其特异性高，且非常稳定，保证了反应的顺利进行，进一步确保柑橘衰退病毒与柑橘裂皮病毒检出的特异性。4.功能更多：本专利技术同时使用柑橘衰退病毒与柑橘裂皮病毒的特异性引物和不同荧光标记的特异探针，结果读取时使用两个不同的荧光检测通道，一次实验可同时检出2种病毒，减少了实验时间和步骤。5.检测速度快：本专利技术提供的方法和试剂盒方便快捷，整个检测时间仅需要数小时，节省大量人力成本和时间成本。检索相关的研究及专利文献未见有柑橘衰退病毒与柑橘裂皮病毒双重数字PCR定量检测的相关文献报道。
技术实现思路
一种柑橘衰退病毒与柑橘裂皮病毒双重检测试剂盒，其组成包括：病样RNA提取试剂、cDNA合成试剂、数字PCR反应试剂、柑橘衰退病与柑橘裂皮病阳性对照样品模板和阴性对照样品模板。其中，所述病样RNA提取试剂的组成为：一包RNase-free的无菌1.5mL ep管50个，50mL的TRIzoL一瓶，6mL氯仿一瓶，25mL异丙醇一瓶，50mL的75vol％乙醇一瓶，50mL的Rnase-free ddH2O一瓶。所述cDNA合成试剂的组成为：各组分浓度为2.5mmol/L each 的1mL dNTP mix一支，200U/μL M-MLV反转录酶50μL，浓度为50μmol /L的随机引物200μL，浓度为40U/μL的50μL RNase Inhibitor一支，5×RT buffer一支200 μL。所述数字PCR反应试剂的组成成分为：1mL RNase-free ddH2O 1支，1mL 2×3D Digital PCR Master Mix 3支，200μL 浓度为10μmol/L的引物STB1-F/STB1-R/ LPB1-F/LPB1-R各1支，200μL 浓度为10μmol/L的探针STB1-P以及LPB1-P各1支，1mL浓度为50ng/μL的柑橘衰退病病样cDNA 1支作为阳性对照样品模板，1mL浓度为50ng/μL的柑橘裂皮病病样cDNA 1支作为阳性对照样品模板，1mL浓度为50ng/μL的健康柑橘样品cDNA 1支作为阴性对照样品模板。所述引物与探针的序列为：柑橘衰退病毒的特异引物及探针为：上游引物STB1-F：5'- TGTGCTGTGTACATACAAGCTAAAG -3'下游引物STB1-R：5'- ATTTCCCAAGCTGCCTGAC -3'探针STB1-P：FAM 5’- GTAACTACRACHTCATCAGCCCCTCG -3’ BHQ所述探针5’ 端荧光报告基因为FAM，3’ 端淬灭基团为BHQ；柑橘裂皮病毒的特异引物及探针为：上游引物LPB1-F：5'- GGAAACCTGGAGGAAGTCG -3'下游引物LPB1 -R：5'- CAGCAGCGAAAGGAAGGAG -3'探针LPB1 -P：HEX 5'- CCTGTTTCTCCGCTGGACGCC -3' BHQ所述探针5’端荧光报告基因为HEX，3’端淬灭基团为BHQ。上述柑橘衰退病毒与柑橘裂皮病毒双重检测试剂盒用于柑橘衰退病毒与柑橘裂皮病毒双重数字PCR定量检测，其具体检测方法包括如下步骤：（1）提取柑橘病样RNA：称取0.05- 0.1g柑橘病叶于-80℃预冷研钵中，加液氮充分研磨；迅速转入到RNase-free的1.5mL无菌ep管中；加入1mL TRIzoL混匀，室温剧烈震荡15s后于室温下静置5min；加入0.2mL氯仿，室温剧烈震荡15s，室温放置5min；12,000rpm，4℃下离心15min，可见分为三层；将含有RNA的上层水相转移至一新的1.5mL无菌ep管中，加入等体积溶液异丙醇，混匀，放置15min；12,000rpm，4℃下离心10min，即可见有RNA 沉淀；弃上清留沉淀，加入1mL于-20℃预冷的75vol％乙醇，漂洗沉淀；12000rpm，4℃下离心5min，弃上清；室温充分干燥RNA 沉淀；加15μL RNase-Free ddH2O溶解沉淀即为总RNA样品，样品即可用于反转录合成cDNA。（2）反转录合成cDNA：RT-PCR反应体系20μL，反应步骤如下：总RNA样品2μL，50μmol/L的随机引物1μL，RNase-free ddH2O 7μL，65℃变性5min，迅速置冰上5 min；再加入5×RT buffer 4μL，各组分浓本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种柑橘衰退病毒与柑橘裂皮病毒双重检测试剂盒，其特征在于，其组成包括：病样RNA提取试剂、cDNA合成试剂、数字PCR反应试剂、柑橘衰退病与柑橘裂皮病阳性对照样品模板和阴性对照样品模板。
【技术特征摘要】
1.一种柑橘衰退病毒与柑橘裂皮病毒双重检测试剂盒，其特征在于，其组成包括：病样RNA提取试剂、cDNA合成试剂、数字PCR反应试剂、柑橘衰退病与柑橘裂皮病阳性对照样品模板和阴性对照样品模板。2.如权利要求1所述的一种柑橘衰退病毒与柑橘裂皮病毒双重检测试剂盒，其特征在于，所述病样RNA提取试剂的组成为：一包RNase-free的无菌1.5mL ep管50个，50mL的TRIzoL一瓶，6mL氯仿一瓶，25mL异丙醇一瓶，50mL的75vol％乙醇一瓶，50mL的Rnase-free ddH2O一瓶。3.如权利要求1所述的一种柑橘衰退病毒与柑橘裂皮病毒双重检测试剂盒，其特征在于，所述cDNA合成试剂的组成为：各组分浓度为2.5mmol/L each 的1mL dNTP mix一支，200U/μL M-MLV反转录酶50μL，浓度为50μmol /L的随机引物200μL，浓度为40U/μL的50μL RNase Inhibitor一支，5×RT buffer一支200 μL。4.如权利要求1所述的一种柑橘衰退病毒与柑橘裂皮病毒双重检测试剂盒，其特征在于，所述数字PCR反应试剂的组成成分为：1mL RNase-free ddH2O 1支，1mL 2×3D Digital PCR Master Mix 3支，200μL 浓度为10μmol/L的引物STB1-F/STB1-R/ LPB1-F/LPB1-R各1支，200μL 浓度为10μmol/L的探针STB1-P以及LPB1-P各1支，1mL浓度为50ng/μL的柑橘衰退病病样cDNA 1支作为阳性对照样品模板，1mL浓度为50ng/μL的柑橘裂皮病病样cDNA 1支作为阳性对照样品模板，1mL浓度为50ng/μL的健康柑橘样品cDNA 1支作为阴性对照样品模板。5.如权利要求4所述的用于柑橘衰退病毒与柑橘裂皮病毒双重数字PCR定量检测的引物及探针，其特征在于，所述引物与探针的序列为：柑橘衰退病毒的特异引物及探针为：上游引物STB1-F：5'- TGTG...
【专利技术属性】
技术研发人员：程保平，彭埃天，赵弘巍，宋晓兵，凌金锋，陈霞，
申请(专利权)人：广东省农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：广东;44
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