检测鸡源性成分的LAMP方法的引物及其设计方法技术

本发明专利技术公开了检测鸡源性成分的LAMP方法的引物及其设计方法，如序列表所示。设计方法包括步骤1，登陆NCBI网站，查找鸡的线粒体基因序列；步骤2，用DNAman软件对鸡的线粒体基因序列进行比对，找出鸡的特异性序列；步骤3，采用软件作为辅助进行引物设计，引物的设计原则包括Tm值、引物末端的安定性、GC含量、引物之间的距离和二级结构；步骤4，建立LAMP检测方法，优化引物工作浓度、内外引物浓度比和反应温度。本发明专利技术具有操作简便、快速，特异性强，灵敏度高等优点，最快仅需不到10分钟，就可实时检测出鸡源性成分。能大大方便口岸进出口货物的通关速度。这对于预防和控制我国动物源性成分掺假具有重要的现实意义。

Primers and design methods of LAMP method for detecting the origin of chicken

The invention discloses a primer and a design method of the LAMP method for detecting the origin of a chicken, as shown in an order list. The design method includes the steps of 1, NCBI landing site, mitochondrial gene sequence search of chickens; step 2, comparing the mitochondrial gene sequence of chicken with DNAman software, find out the specific sequence of chicken; step 3, using the software as auxiliary primer design, primer design principles including the Tm value, the stability of the primer terminus the content of GC, primer, distance and two level structure; step 4, the establishment of LAMP detection method, optimization of primer concentration, primer concentration and ratio and reaction temperature. The invention has the advantages of simple and quick operation, high specificity and high sensitivity. It can detect chicken derived ingredients in real time only in less than 10 minutes. It can greatly facilitate the customs clearance of the import and export goods at the port. It is of great practical significance for the prevention and control of adulteration of animal derived components in China.

【技术实现步骤摘要】
检测鸡源性成分的LAMP方法的引物及其设计方法
本专利技术涉及鸡源性成分的检测，具体是涉及一种用于检测鸡源性成分的LAMP引物及其设计方法。
技术介绍
近年检测动物源性掺假的技术主要是针对动物特异性核酸或蛋白，有蛋白印迹、ELISA、核酸探针、PCR和荧光PCR等，目前使用最为广泛的是PCR和荧光PCR。PCR方法由于其具有较高的灵敏度而能够在动物源性成分检测中得到广泛的应用。但在实际运用中，还是存在一些难以难以克服的问题，如假阴性、假阳性、非特异性扩增以及片状拖带、涂抹带等等。环介导等温扩增(Loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)，是一种新型的核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，在链置换DNA聚合酶(BstDNApolymerase)的作用下，60～65℃恒温扩增，15～60min左右即可实现109～1010倍的核酸扩增，具有操作简单、特异性强、产物易检测等特点。在DNA合成时，从脱氧核糖核酸三磷酸底物(dNTPs)中析出的焦磷酸离子与反应溶液中的镁离子反应，产生大量焦磷酸镁沉淀，呈现白色。因此，可以把浑浊度作为反应的指标，只用肉眼观察白色浑浊沉淀，就能鉴定扩增与否，而不需要繁琐的电泳和紫外观察。由于环介导等温扩增反应不需要PCR仪和昂贵的试剂，有着广泛的应用前景。GenieII等温扩增荧光检测系统是开放的检测平台，应用“等温扩增技术”原理，结合荧光检测技术，可用于各类等温扩增反应在分子水平基础上进行快速检测工作。鸡源性成分检测常用PCR和荧光定量PCR方法，常规PCR方法需要2h左右的PCR反应时间，30min左右的电泳时间以及配置凝胶和染色的时间；荧光定量PCR方法，大概需要1h左右的时间，且荧光探针和仪器都较昂贵。
技术实现思路
为了解决快速检测进出口及市场上的鸡源性成分，本专利技术提供一种用于检测鸡源性成分的LAMP引物及其设计方法，该LAMP引物组合具有简单、灵敏、快速、特异的优点。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种用于检测鸡源性成分的LAMP引物，引物序列如下所示：（如序列表）鸡F3：5′-CATCCAACATCTCTGCTTGA-3′鸡B3：5′-GAGTGTGAGGAGGAGGATTA-3′鸡FIP：5′-TCAGCCGTATTGTACGTTCCGCTAGCCATGCACTACACAG-3′鸡BIP：5′-CATCCGGAATCTCCACGCAACGTCCGATGTGAAGGAAG-3′鸡LoopF：5′-TACGGAGGAGAAGGCTAGG-3′鸡LoopB：5′-CGCCTCATTCTTCTTCATCTGT-3′。在上述用于检测鸡源性成分的LAMP引物的设计方法中，包括以下步骤：步骤1，登陆NCBI网站，查找鸡的线粒体基因序列；步骤2，用DNAman软件对鸡的线粒体基因序列进行比对，找出鸡的特异性序列；步骤3，采用软件作为辅助进行引物设计，引物的设计原则包括Tm值、引物末端的安定性、GC含量、引物之间的距离和二级结构；步骤4，建立LAMP检测方法，优化引物工作浓度、内外引物浓度比和反应温度。在上述设计方法中，在步骤2中，所述用DNAman软件对鸡的线粒体基因序列进行比对，选择CytB基因作为鸡源性成分的检测基因。在上述设计方法中，在步骤3中，所述软件为PrimerExplorerV3，各条引物的参数如下：F1c/B1c，64～66℃；F2/B2/F3/B3LoopF/LoopB，59～61℃；所述引物F1c和B1c比其余几条引物的Tm值高5℃。在上述设计方法中，在步骤3中，所述引物末端的安定性：引物F1c/B1c的5‘端的△G值≤-4Kcal/mol，引物F2/B2/F3/B3LoopF/LoopB的3’端的△G值≤-4Kcal/mol，引物末端不能含有互补序列，如cccggg或gaattc；也不能含有相同的核苷酸，如ccgggg或aatttt。在上述设计方法中，在步骤3中，所述GC含量的设定范围在40%～65%。在上述设计方法中，在步骤3中，所述引物之间的距离：从F25‘端到B25‘端在120～180bp之间，从F2的5’端到F1c的3‘端在40-60bp之间，从F2的5’端到F3的3‘端在0～20bp之间。关于二级结构，引物自身不能形成二级结构。本专利技术检测时间不添加加速引物LoopF和LoopB，反应时间需30min左右；添加一条加速引物LoopF或LoopB，反应时间需20-25min；添加两条加速引物LoopF和LoopB，反应时间仅需15-20min。且试验中途即可观察结果、判定结果，不需要配置凝胶、电泳、染色等过程，极大缩短了检测时间，且有与荧光定量PCR类似的曲线、判定原则和标准，具有快速、特异、敏感、节约费用等优点，适应于口岸快速检测的需要，是一种准确、可靠、科学的分子生物学方法。这对于加强产品鸡源性成分快速检验检疫、整顿制售掺假产品、维护消费者权益、打击违法牟取暴利等方面都具有十分重要的意义。本专利技术的有益效果如下：1.本专利技术技术最核心在于引物不同，虽然引物的设计有借助软件，但是软件只是一种辅助手段，并不具有决定性作用,要获得一组特异性高、灵敏度高的引物具有偶然性。并不是经过“有限次试验”就能够筛选得到的。本专利技术经过大量实验才获得该引物序列，每条引物上碱基的不同或者排序的不同，其结果是差异很大的，从排列组合的角度来讲，可以有数以万计的不同结果。而这一些不可能单靠软件来解决，比如改变了第二个碱基，其检查结果就有较大差异。2.采用本专利技术建立的检测鸡源性成分的LAMP方法，具有操作简便、快速，特异性强，灵敏度高等优点，最快仅需不到10分钟，就可实时检测出鸡源性成分。本专利技术的成功研制，大大加快了鸡源性成分的检测。3.采用本专利技术的检测鸡源性成分的LAMP技术，具有简单、灵敏、快速、特异等优点，能大大方便口岸进出口货物的通关速度。这对于预防和控制我国动物源性成分掺假具有重要的现实意义。本专利技术的引物在GenieII操作平台上进行应用。附图说明图1为LAMP技术检测鸡源性成分的内外引物工作浓度比优化结果。在图1中，1：FIP/BIP与F3/B3的浓度比1:1；2：FIP/BIP与F3/B3的浓度比2:1；3：FIP/BIP与F3/B3的浓度比3:1；4：FIP/BIP与F3/B3的浓度比4:1；5：FIP/BIP与F3/B3的浓度比5:1；6：FIP/BIP与F3/B3的浓度比6:1；7：FIP/BIP与F3/B3的浓度比7:1；8：空白对照。图2为LAMP技术检测鸡源性成分的引物工作浓度优化结果。在图2中，1：FIP、BIP、F3和B3的工作浓度分别为0.4、0.4、0.1和0.1µM；2：FIP、BIP、F3和B3的工作浓度分别为0.8、0.8、0.2和0.2µM；3：FIP、BIP、F3和B3的工作浓度分别为1.6、1.6、0.4和0.4µM；4：FIP、BIP、F3和B3的工作浓度分别为3.2、3.2、0.8和0.8µM；5：FIP、BIP、F3和B3的工作浓度分别为6.4、6.4、1.6和1.6µM；6：FIP、BIP、F3和B3的工作浓度分别为12.8、12.8、3.2和3.2µM；本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测鸡源性成分的LAMP引物，其特征在于引物序列如下所示：鸡F3：5′‑CATCCAACATCTCTGCTTGA‑3′鸡B3：5′‑GAGTGTGAGGAGGAGGATTA‑3′鸡FIP：5′‑TCAGCCGTATTGTACGTTCCGCTAGCCATGCACTACACAG‑3′鸡BIP：5′‑CATCCGGAATCTCCACGCAACGTCCGATGTGAAGGAAG‑3′鸡LoopF：5′‑TACGGAGGAGAAGGCTAGG‑3′鸡LoopB：5′‑CGCCTCATTCTTCTTCATCTGT‑3′。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测鸡源性成分的LAMP引物，其特征在于引物序列如下所示：鸡F3：5′-CATCCAACATCTCTGCTTGA-3′鸡B3：5′-GAGTGTGAGGAGGAGGATTA-3′鸡FIP：5′-TCAGCCGTATTGTACGTTCCGCTAGCCATGCACTACACAG-3′鸡BIP：5′-CATCCGGAATCTCCACGCAACGTCCGATGTGAAGGAAG-3′鸡LoopF：5′-TACGGAGGAGAAGGCTAGG-3′鸡LoopB：5′-CGCCTCATTCTTCTTCATCTGT-3′。2.权利要求1所述用于检测鸡源性成分的LAMP引物的设计方法，其特征在于包括以下步骤：步骤1，登陆NCBI网站，查找鸡的线粒体基因序列；步骤2，用DNAman软件对鸡的线粒体基因序列进行比对，找出鸡的特异性序列；步骤3，采用软件作为辅助进行引物设计，引物的设计原则包括Tm值、引物末端的安定性、GC含量、引物之间的距离和二级结构；步骤4，建立LAMP检测方法，优化引物工作浓度、内外引物浓度比和反应温度。3.如权利要求2所述的设计方...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐淑菲，孔繁德，唐泰山，苗丽，
申请(专利权)人：厦门出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：福建,35