一种高通量富集和检测致病性副溶血性弧菌的方法技术

本发明专利技术涉及一种高通量富集和检测致病性副溶血性弧菌的方法，属于生物检测技术领域，所述的方法将IMS‑Pathatrix系统和环介导等温扩增技术结合在一起。本发明专利技术还提供该方法涉及的引物组合和检测试剂盒。其优点表现在：同现有技术相比，通过将免疫富集和环介导等温扩增技术相结合，检测灵敏度可达到2.97log CFU/mL。操作简便、耗时短、特异性强、灵敏度高，且能与诸多检测技术联合使用，提高了致病性副溶血性弧菌的检出率和灵敏度。

A method for high throughput enrichment and detection of pathogenic Vibrio parahaemolyticus

The invention relates to a method for high-throughput enrichment and detection of pathogenic Vibrio parahaemolyticus, which belongs to the technical field of biological detection, the method of IMS Pathatrix system and loop mediated isothermal amplification technology together. The invention also provides a primer combination and a detection kit involved in the method. Its advantages are: compared with the prior art, the immune enrichment and loop mediated isothermal amplification technology, the detection sensitivity can reach 2.97log CFU/mL. It has the advantages of simple operation, short time consumption, high specificity and high sensitivity, and can be combined with many detection technologies, which improves the detection rate and sensitivity of pathogenic Vibrio parahaemolyticus.

【技术实现步骤摘要】
一种高通量富集和检测致病性副溶血性弧菌的方法
本专利技术涉及生物检测
，具体地说，是一种高通量富集和检测致病性副溶血性弧菌的方法。
技术介绍
副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)是一种重要的食源性致病菌，在自然环境中，并非所有分离的副溶血性弧菌都携带致病因子，其中耐热溶血毒素(TDH)、耐热相关溶血毒素(TRH)、T2SS和T3SS等被确认为致病性副溶血性弧菌重要的毒力因子。一旦食用被致病性副溶血性弧菌污染的水产品，易引起腹泻、肠痉挛、恶心、呕吐、发热等典型胃肠道症状。因此对致病性副溶血性弧菌的检测是水产品安全检测的重要内容。副溶血性弧菌的传统检测需要经过前增菌、选择性培养、生理生化鉴定和血清学反应等过程，操作繁琐、耗时长、检出率低，不利于及时诊断和流行病学的溯源。近年来随着生物技术的发展，PCR、DNA探针、ELISA等相关技术已广泛应用于致病性副溶血性弧菌的检测，但若样品为低污染水平，通常需要经过前增菌培养以达到检测极限，检测时间大大延长。环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)利用6种特异性引物，在DNA聚合酶作用下1h内即可完成体外扩增，具有低成本、特异性强、灵敏度高等特点。免疫磁分离(ImmonumagneticSeparation，IMS)技术是一种对细胞和微生物进行分离和富集捕获的免疫学方法。待测样品中的复杂组分往往会干扰致病性副溶血性弧菌检测的准确性，免疫磁分离技术具备快速富集捕获目的靶标并防止其它杂质干扰的优势。目标菌体细胞表面抗原与连有磁珠的抗体结合形成菌体细胞和免疫磁珠复合物，该复合物在磁场作用下会聚集在磁场周围，从而与其它物质分离，是有效的样品前处理方法。利用Pathatrix系统可同时对五个样品进行IMS分离，并在15分钟内完成目标菌的富集，缩短捕获时间，实现快速富集目标菌体，并可连接LAMP技术实现对待检样品在分子水平的检测。中国专利文献CN102586157A公开了一种高通量富集、捕获副溶血性弧菌的方法，采用副溶血性弧菌的多克隆抗体，利用EDC/NHS活化法将所述副溶血性弧菌的多克隆抗体偶联在表面包被着羧基的磁珠上，获得捕获副溶血性弧菌的免疫磁珠；重悬已偶联多抗的免疫磁珠，将其加入到反应管中，再加入反应液和样品液，在洗脱管中加入洗涤液，采用Pathatrix系统进行免疫富集。中国专利文献CN102586452A公开了一种副溶血性弧菌的检测试剂盒，包括(1)免疫富集反应体系组分、(2)环介导核酸等温扩增体系组分、(3)一套基于副溶血性弧菌tlh基因的环介导等温扩增技术的特异性引物：两条外引物F3、B3，两条内引物FIP、BIP，两条环引物LF、LB。但是关于本专利技术的通过IMS-Pathatrix系统和LAMP结合在一起的高通量富集和检测致病性副溶血性弧菌的方法目前还未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中的不足，提供一种用于高通量富集和检测致病性副溶血性弧菌的引物组合。本专利技术的第二个目的是，提供一种致病性副溶血性弧菌的检测试剂盒。本专利技术的第三个目的是，提供一种高通量富集、检测致病性副溶血性弧菌的方法。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案是：一种通过免疫磁分离富集与环介导等温扩增结合检测致病性副溶血性弧菌的引物组合，所述的引物组合由引物F3、B3、FIP、BIP、LF和LB组成，F3引物序列如SEQIDNO：1所示，B3引物序列如SEQIDNO：2所示，FIP引物序列如SEQIDNO：3所示，BIP引物序列如SEQIDNO：4所示，LF引物序列如SEQIDNO：5所示，LB引物序列如SEQIDNO：6所示。为实现上述第二个目的，本专利技术采取的技术方案是：所述的引物组合在制备致病性副溶血性弧菌的检测试剂盒中应用。一种致病性副溶血性弧菌的检测试剂盒，所述的检测试剂盒包括免疫富集反应体系组分和环介导核酸等温扩增体系组分，所述的免疫富集反应体系组分包括：偶联了致病性副溶血性弧菌多克隆抗体的直径1.0-2.8μm免疫磁珠；含0.02％w/vNaN3、以及含0.1％w/vBSA的pH7.4的PBS免疫磁珠保护液；含有1％w/vBSA的pH7.4的PBS免疫磁珠工作液；0.05mol/L、pH6.4的Tris-HCl作为免疫富集反应液；含0.05％Tween-20的pH7.4的PBS免疫富集洗脱液。所述的致病性副溶血性弧菌多克隆抗体通过如下方法制得：制备免疫抗原、免疫动物、测定血清效价、纯化抗血清、抗体特异性检测。环介导核酸等温扩增体系组分包括引物F3、B3、FIP、BIP、LF和LB，F3引物序列如SEQIDNO：1所示，B3引物序列如SEQIDNO：2所示，FIP引物序列如SEQIDNO：3所示，BIP引物序列如SEQIDNO：4所示，LF引物序列如SEQIDNO：5所示，LB引物序列如SEQIDNO：6所示。环介导核酸等温扩增体系组分包括：0.2％Tween-20、40mMTris碱、20mMKCl、20mM(NH4)2SO4、6mMMgSO4、20μMLF/LB、20μMF3/B3、20μMFIP/BIP、8000U/mLBstDNA聚合酶、10mMdNTP。为实现上述第三个目的，本专利技术采取的技术方案是：一种高通量富集和检测致病性副溶血性弧菌的方法，所述的方法使用前述的检测试剂盒。所述的方法包括免疫磁分离和环介导等温扩增步骤。免疫磁分离应用Pathatrix系统对副溶血性弧菌进行富集捕获。本专利技术优点在于：本专利技术的致病性副溶血性弧菌检测试剂盒及其检测方法同现有技术相比，通过将免疫富集和环介导等温扩增技术相结合，检测灵敏度可达到2.97logCFU/mL，具有操作过程简便、耗时短、特异性强、灵敏度高等优点。该方法可以同时处理五个样品并有效的分析样品带菌状态，大大节省劳动力，可广泛应用于各级食品药品监督管理机构、疾病预防控制实验室等对水产品和临床病人胃肠道呕吐物、血液、粪便等样品中致病性副溶血性弧菌的富集捕获和后续检测。附图说明附图1为IMS-Pathatrix-LAMP特异性检测电泳结果示意图。M：100bpmarker；“-”：阴性对照；1.ATCC33846；2.ATCC33847；3.VP81；4.WTD43；5.WTD45；6.WTD46；7.WTD47；8.Bb221；9.F36；10.G5；11.G6；12.G7；13.G8；14.霍乱弧菌；15.创伤弧菌；16.大肠杆菌；17.肠炎沙门氏菌；18.单增李斯特氏菌；19.铜绿假单胞菌；20.金黄色葡萄球菌；21.耶尔森氏菌。附图2为IMS-Pathatrix-LAMP纯菌液灵敏度检测电泳结果示意图。M：100bpmarker；“-”：阴性对照；1-8：1.22×108CFU/mL-1.22×101CFU/mL。附图3为IMS-Pathatrix-LAMP人工污染虾样灵敏度检测电泳结果示意图。M：100bpmarker；1-8：9.40×106CFU/mL-9.40×10-2CFU/mL。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术提供的具体实施方式作详细说明。一种致病性副溶血性弧菌的检测试剂盒，包括：(1)免疫富集反应体系组本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种通过免疫磁分离与环介导等温扩增结合检测致病性副溶血性弧菌的引物组合，其特征在于，所述的引物组合由引物F3、B3、FIP、BIP、LF和LB组成，F3引物序列如SEQ ID NO：1所示，B3引物序列如SEQ ID NO：2所示，FIP引物序列如SEQ ID NO：3所示，BIP引物序列如SEQ ID NO：4所示，LF引物序列如SEQ ID NO：5所示，LB引物序列如SEQ ID NO：6所示。

【技术特征摘要】
1.一种通过免疫磁分离与环介导等温扩增结合检测致病性副溶血性弧菌的引物组合，其特征在于，所述的引物组合由引物F3、B3、FIP、BIP、LF和LB组成，F3引物序列如SEQIDNO：1所示，B3引物序列如SEQIDNO：2所示，FIP引物序列如SEQIDNO：3所示，BIP引物序列如SEQIDNO：4所示，LF引物序列如SEQIDNO：5所示，LB引物序列如SEQIDNO：6所示。2.根据权利要求1所述的引物组合在制备致病性副溶血性弧菌的检测试剂盒中应用。3.一种致病性副溶血性弧菌的检测试剂盒，其特征在于，所述的检测试剂盒包括免疫富集反应体系组分和环介导核酸等温扩增体系组分，所述的免疫富集反应体系组分包括：偶联了致病性副溶血性弧菌多克隆抗体的直径1.0-2.8μm免疫磁珠；含0.02％w/vNaN3、以及含0.1％w/vBSA的pH7.4的PBS免疫磁珠保护液；含有1％w/vBSA的pH7.4的PBS免疫磁珠工作液；0.05mol/L、pH6.4的Tris-HCl作为免疫富集反应液；含0.05％Tween-20的pH7.4的PBS免疫富集洗脱液。4.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的致病性副溶血性弧菌多克隆抗体通过如...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙晓红，张玉洁，苏晨曦，赵勇，卢瑛，潘迎捷，
申请(专利权)人：上海海洋大学，
类型：发明
国别省市：上海,31