羊传染性脓疱病毒和绵羊肺炎支原体双重PCR专用引物制造技术

本发明专利技术提供了一种羊传染性脓疱病毒和绵羊肺炎支原体双重PCR专用引物，该专用引物根据羊传染性脓疱病毒的B2L基因和绵羊肺炎支原体的P80基因序列，设计了两对可扩增B2L基因和P80基因的特异性引物。通过对引物浓度、退火温度等条件的优化，建立了快速检测羊传染性脓疱病毒和绵羊肺炎支原体双重PCR方法。电泳图中出现402bp的特异性片段为羊传染性脓疱病毒阳性；出现700bp的特异性片段为绵羊肺炎支原体阳性。本发明专利技术可实现同一反应体系中对羊传染性脓疱病毒和绵羊肺炎支原体进行检测，具有快速、特异、准确诊断病原等优点，为生产中这两种病原感染的鉴别诊断和流行病学调查提供了新的方法。

Sheep infectious pustular virus and Mycoplasma pneumoniae Mycoplasma double PCR primers

The invention provides a sheep contagious pustular dermatitis virus and Mycoplasma pneumoniae double PCR specific primers, the specific primers according to the sequence of P80 gene and B2L gene of Mycoplasma pneumoniae orf virus, two pairs of specific primers designed to amplify the B2L gene and P80 gene. Through the optimization of primers concentration and annealing temperature, a double PCR method for rapid detection of sheep infectious pustular virus and Mycoplasma pneumoniae was established. The specific fragment of 402bp in the electrophoresis map was positive for sheep infectious pustular virus, and the specific fragment of 700bp appeared positive for Mycoplasma pneumoniae. The invention can detect contagious pustular dermatitis virus and Mycoplasma pneumoniae to achieve the same reaction system, which is rapid, specific and accurate diagnosis of pathogens and other advantages, provide a new method for differential diagnosis and epidemiological investigation of these two kinds of pathogens in production.

【技术实现步骤摘要】
羊传染性脓疱病毒和绵羊肺炎支原体双重PCR专用引物
本专利技术涉及羊传染性脓疱病毒和绵羊肺炎支原体双重PCR专用引物及双重PCR检测方法，属于预防兽医学领域。
技术介绍
羊传染性脓疱病（Contagiousecthyma,CE）俗称羊口疮（Orf），是由羊传染性脓疱病毒(Orfvirus,ORFV)感染引起的山羊、绵羊和人的一种急性、接触性和嗜上皮性的人畜共患病。该病的发病率为4%-100%，死亡率为1%-59%。绵羊肺炎支原体(Mycoplasmaovipneumoniae，Mo)是引起绵羊和山羊支原体性肺炎的主要病原体之一，羊支原体性肺炎临床症状表现为高热、咳嗽、喘气、渐进性消瘦、肺和胸膜发生浆液性和纤维素性炎症,发病率为20%-60%，病死率一般为30%～50%,有的高达80%。Mo结构复杂、培养困难，目前仍缺乏有效的生前诊断和防治措施，给养羊业造成巨大经济损失。我国羊病的发生已日趋复杂，多重感染较为普遍，给羊病防治造成很大困难。当前确诊羊支原体性肺炎的方法主要是病原分离鉴定,但是支原体的体外培养成本较高,培养条件要求苛刻,生长缓慢,尤其是绵羊肺炎支原体很难培养，临床病例确诊一般需要2-3周时间,显然不能满足快速诊断的需要。，而PCR方法简单、快速、准确，已成为实验室诊断常用方法。国内外一些学者应用PCR技术对羊传染性脓疱病和山羊传染性胸膜肺炎进行了诊断和流行病学研究,国内的屈勇刚等、李媛等、储岳峰等分别建立了绵羊肺炎支原体PCR检测方法及绵羊肺炎支原体和丝状支原体山羊亚种二重PCR检测方法,颜新敏等建立了快速鉴别诊断羊痘病毒和羊口疮病毒的双重PCR方法，但目前国内外尚无同时快速检测羊传染性脓疱病毒和绵羊肺炎支原体方法的报道。本专利技术提供快速、特异、灵敏的鉴别或同时检测羊传染性脓疱病毒和绵羊肺炎支原体的双重PCR专用引物和双重PCR检测方法,适用于临床快速检测和流行病学调查，有广阔的应用前景，具有重大的经济和社会效益。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种羊传染性脓疱病毒和绵羊肺炎支原体双重PCR专用引物及其检测方法，具体为一种快速、特异、准确诊断羊传染性脓疱病毒和绵羊肺炎支原体专用引物及双重PCR检测方法。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：羊传染性脓疱病毒和绵羊肺炎支原体专用引物设计；羊传染性脓疱病毒和绵羊肺炎支原体双重PCR检测方法的建立；从待检羊的鼻拭子或鼻、唇等结痂处提取组织DNA，然后将获得的DNA模板以及针对羊传染性脓疱病毒B2L基因和绵羊肺炎支原体P80基因设计合成的两对引物加入到同一个反应体系中进行PCR扩增，PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定；其中，PCR反应的专用引物序列分别为：专用引物B2L上游序列5’-AGGCGGGCGTCAACTACTACAA-3’，专用引物B2L下游序列5’-TTCTTGGCGTTCTCGATGCGGT-3’。用于扩增羊传染性脓疱病毒B2L基因，目的片段为402bp。专用引物P80上游序列5’-GCCTTGGGGTTGGAATTCCTTTGTCTTATTC-3’，专用引物P80下游序列5’-CATTTGATGCTGAGGTCGGATTTGGACTAAC-3’。用于扩增绵羊肺炎支原体P80基因，目的片段为700bp。PCR反应体系和扩增程序分别如下：PCR反应体系：反应体系为20μL，PremixTaqTMVersion2.0plusdye10μL、B2L上下游引物各0.7μL、P80上下游引物各1.2μL、模板各1μL、无菌去离子水补足至20μL；扩增程序：94℃预变性2min，从94℃变性30sec，58.5℃退火15sec，72℃延伸15sec运行30个循环；72℃延伸10min。本专利技术根据羊传染性脓疱病毒B2L基因和绵羊肺炎支原体P80基因序列，设计两对可特异性扩增B2L基因和P80基因的专用引物，建立了羊传染性脓疱病毒和绵羊肺炎支原体双重PCR检测方法。本专利技术的优点在于：通过对引物浓度、退火温度等条件的优化，建立了快速检测羊传染性脓疱病毒和绵羊肺炎支原体双重PCR方法。电泳图中出现402bp的特异性片段为羊传染性脓疱病毒阳性；出现700bp的特异性片段为绵羊肺炎支原体阳性。本专利技术可实现同一反应体系中对羊传染性脓疱病毒和绵羊肺炎支原体进行检测，具有快速、特异、准确诊断病原等优点，为生产中这两种病原感染的鉴别诊断和流行病学调查提供了新的方法。附图说明图1为专用引物B2L对羊传染性脓疱病毒PCR扩增产物电泳图；其中M为Marker，泳道1为羊传染性脓疱病毒的目标片段，泳道2绵羊肺炎支原体Y98、泳道3山羊支原体山羊肺炎亚种F38、泳道4丝状支原体山羊亚种PG3、泳道5副猪嗜血杆菌、泳道6大肠杆菌、泳道7金黄色葡萄球菌、泳道8莱氏无胆甾原体、泳道9多杀性巴氏杆菌和泳道10空白对照均无条带。图2为专用引物Mo对绵羊肺炎支原体PCR扩增产物电泳图；其中M为Marker，泳道1为绵羊肺炎支原体目标片段，泳道2山羊支原体山羊肺炎亚种、泳道3羊传染性脓疱病毒、泳道4丝状支原体山羊亚种、泳道5副猪嗜血杆菌、泳道6大肠杆菌、泳道7莱氏无胆甾原体、泳道8金黄色葡萄球菌、泳道9多杀性巴氏杆菌和泳道10空白对照均无条带。图3为双重PCR方法特异性试验结果电泳图；其中M为Marker，泳道1为羊传染性脓疱病毒和绵羊肺炎支原体的混合模板，泳道2为羊传染性脓疱病毒模板，泳道3为绵羊肺炎支原体模板，泳道4为丝状支原体山羊亚种模板、泳道5为副猪嗜血杆菌模板、泳道6为大肠杆菌模板、泳道7为莱氏无胆甾原体模板、泳道8为金黄色葡萄球菌模板、泳道9为多杀性巴氏杆菌模板、泳道10为山羊支原体山羊肺炎亚种和泳道11为空白对照均无条带。图4为双重PCR敏感性试验结果电泳图；图中：M为Marker，泳道1至泳道9分别为10-1-10-910倍系列稀释的羊传染性脓疱病毒和绵羊肺炎支原体DNA的混合模板，泳道10为空白对照。图5为双重PCR重复性试验结果电泳图；其中M为Marker，泳道9至泳道12为羊传染性脓疱病毒，泳道13和泳道18为绵羊肺炎支原体，泳道19为羊传染性脓疱病毒和绵羊肺炎支原体的混合模板；泳道1至泳道8分别为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌、莱氏无胆甾原体、丝状支原体山羊亚种、山羊支原体山羊肺炎亚种、副猪嗜血杆菌和空白对照无菌去离子水。具体实施方式以下结合实施例对本专利技术作进一步阐述，便于更好地理解本专利技术，但并不限制本专利技术。以下实施例对羊传染性脓疱病毒和绵羊肺炎支原体用单重PCR及双重PCR方法进行阐述。实施例1本专利技术快速检测羊传染性脓疱病毒的专用引物B2L的设计和用该对专用引物B2L采用单重PCR方法对羊传染性脓疱病毒的检测.(1)检测羊传染性脓疱病毒的专用引物B2L的设计与合成检测羊传染性脓疱病毒的专用引物B2L是根据羊传染性脓疱病毒基因组中B2L基因片段，用Primer6.0引物设计软件，设计特异性引物，将其编号为专用引物B2L，它是由专用引物B2L上游引物和专用引物B2L下游引物组成，所述的专用引物B2L上游引物的碱基序列5’-AGGCGGGCGTCAACTACTACAA-3’，所述的专用引物B2L下游引物的碱基序列5’-TTCTTGGCGTTCTCG本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种羊传染性脓疱病毒和绵羊肺炎支原体双重PCR专用引物，其特征在于：所述的专用引物其序列如下：专用引物B2L上游引物序列5’‑ AGGCGGGCGTCAACTACTACAA‑3’，专用引物B2L下游引物序列5’‑ TTCTTGGCGTTCTCGATGCGGT‑3’；专用引物P80上游引物序列5’‑GCCTTGGGGTTGGAATTCCTTTGTCTTATTC‑3’，专用引物P80下游引物序列5’‑CATTTGATGCTGAGGTCGGATTTGGACTAAC‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种羊传染性脓疱病毒和绵羊肺炎支原体双重PCR专用引物，其特征在于：所述的专用引物其序列如下：专用引物B2L上游引物序列5’-AGGCGGGCGTCAACTACTACAA-3’，专用引物B2L下游引物序列5’-TTCTTGGCGTTCTCGATGCGGT-3’；专用引物P80上游引物序列5’-GCCTTGGGGTTGGAATTCCTTTGTCTTATTC-3’，专用引物P80下游引物序列5’-CATTTGATGCTGAGGTCGGATTTGGACT...

【专利技术属性】
技术研发人员：林裕胜，胡奇林，江锦秀，游伟，
申请(专利权)人：福建省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：福建,35