本发明专利技术公开了一种基于羊传染性脓疱病毒B2L基因的DNA疫苗载体及其制备方法和应用，属于生物药物领域。本发明专利技术的一种基于羊传染性脓疱病毒B2L基因的DNA疫苗载体，其特征是将羊传染性脓疱病毒主要免疫原性基因B2L插入到真核表达载体pVAX1内经大量制备后得到的。将本发明专利技术的制备得到DNA疫苗用于动物免疫，结果发现，与对照组相比，注射了本发明专利技术的DNA疫苗的动物能够有效抵抗羊传染性脓疱病毒的感染，其免疫保护效率达90%以上，因此本发明专利技术的一种DNA疫苗在防治羊传染性脓疱疾病方面将具有广阔的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种DNA疫苗载体及其制备方法和应用，特别设计一种可用于预防羊传染性脓疱的DNA疫苗载体及其制备方法和应用，属于生物药物领域。
技术介绍
羊传染性脓疱(俗称“羊口疮”)是由痘病毒科，副痘病毒属羊传染性脓疱病毒(Orfvirus, 0RFV)引起的一种人畜共患传染病。该病主要危害3 6月龄羔羊和部分成年羊，临床症状表现为嘴唇、口黏膜部分皮肤红疹、脓疱、溃疡和结痂；羔羊表现为齿唇部破溃，不能吃奶,若继发或混合感染其他病原微生物死亡率较高。本病可以通过伤口感染饲养人员 表现为手背、指间和前臂部疱疹和破溃。该病世界范围内发生且广泛流行，因此，羊传染性脓疱的爆发和流行不但严重危害羊产业的健康发展而且威胁人们的身体健康，是一种危害较为严重的人畜共患传染病。临床上尚无有效的药物用于羊传染性脓疱病的防治，疾病处于自限性时，通常使用抗生素阻止细菌继发感染；处于并发症时，常使用局部冷敷疗法或切除法；疾病较为严重时，可进行必要的切除进行治疗。目前，用于生产羊口疮疫苗的毒株是在20年前制备的，随着病毒的变异，保护效率不高。更为严重的是由于羊口疮疫苗制作工艺复杂，市场需求量较其他动物疫苗小等原因，很多动物疫苗企业不愿意进行羊口疮疫苗的生产，导致市场上无羊口疮疫苗供应。因此急需一种制作简单能够预防羊口疮的新型疫苗来进行羊口疮的防控。随着养羊业规模化的快速发展，羊传染性脓疱危害越来越严重，如何提高疫苗的免疫保护效率、降低生产成本、简化免疫程序等成为迫切需要解决的问题，开发研制一种安全、高效、经济、实用的新型疫苗对羊传染性脓疱病的防治意义重大。B2L基因编码42kDa的蛋白，该蛋白是病毒囊膜的成分之一，可刺激机体产生强烈的抗体反应，并刺激淋巴细胞释放(是羊口疮病毒的保护性抗原之一，诱导的免疫反应足以抵抗强毒的攻击。真核表达载体PVAXl是在PcDNA3. I的基础上开发的具有CMV启动子和BGHpoly (A)信号序列，通过了食品与药物管理局批准的可用于DNA疫苗研究的载体。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种能够有效用于羊传染性脓疱病的防治的新型疫苗，本专利技术的疫苗不仅具有高的免疫保护效率，而且具有生产成本低，可大规模生产的特点，能基本满足当前对于羊传染性脓疱病的防治的需要。为达到本专利技术所述的目的，本专利技术采用了以下技术方案本专利技术的一种基于羊传染性脓疱病毒B2L基因的DNA疫苗载体，其特征在于所述的载体是通过将羊传染性脓疱病毒的主要免疫原性基因B2L基因插入到真核表达载体PVAXl内构建得到的。所述的用于基因疫苗的真核表达载体pVAXl是常用的基因疫苗载体，其特征是在其多克隆位点上游引入人巨细胞病毒的立即早期启动子序列，在其多克隆位点下游引入可以有效终止转录和mRNA聚腺苷酸化的牛生长因子(BGH)聚腺苷酸化信号序列，真核表达载体pVAXl的载体图谱如图I所示。在本专利技术中，优选的，所述的B2L基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。进一步的，本专利技术还提供了一种宿主细胞，其特征在于含有本专利技术所述的DNA疫苗载体。在本专利技术中，优选的，所述的宿主细胞为大肠杆菌DH5 a。再进一步的，本专利技术提供了一种构建以上所述的DNA疫苗载体的方法，其特征在于包括以下步骤 I(GGATCC)和Xho I (CTCGAG)酶切位点，所述的引物序列如下所示上游引物Pl TTTGGATCCATGTGGCCGTTCTCCTC下游引物P2 TTTCTCGAGTTAATTTATTGGTTTGC(2)用引物P1，P2，在高保真DNA聚合酶作用下，以羊传染性脓疱病毒DNA为模板，扩增B2L基因，电泳检测并纯化回收该片段；(3)将步骤(2)得到的片段与pVAXl载体分别用限制性内切酶BamH I和Xho I进行酶切，分别获得带有粘性末端的B2L基因片段和PVAXl质粒片段；(4)将步骤(3)得到的两段片段连接，连接产物转化大肠杆菌DH5 α，鉴定正确后，通过小量提取或大量提取制备得到所述的DNA疫苗载体。在本专利技术中，优选的，步骤(2)中的扩增条件为95°C预变性5min后进入循环，循环参数为 95°C lmin、57.5°C lmin、72°C lmin，35 个循环后 72°C延伸 lOmin。在本专利技术中，优选的，扩增得到的B2L基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。更进一步的，本专利技术还提出了所述的DNA疫苗载体在制备预防羊传染性脓疱疾病疫苗中的应用。最后，本专利技术提出了一种用于预防羊传染性脓疱的DNA疫苗，其特征在于含有本专利技术所述的DNA疫苗载体。将本专利技术制备得到DNA疫苗用于动物免疫，结果发现，与对照组相比，注射了本专利技术的DNA疫苗的动物能够有效抵抗羊传染性脓疱病毒的感染，其免疫保护效率达90%以上，因此本专利技术的一种DNA疫苗在防治羊传染性脓疱疾病方面将具有广阔的应用前景。附图说明图I为真核表达载体pVAXl的载体图谱；图2为B2L基因的PCR扩增电泳结果；M:DL2000DNA分子质量标准；1:PCR产物；2 ;空白对照图3为pVAXl-B2L的PCR鉴定和酶切鉴定结果；M:DNA DL2000分子质量标准；I :PCR检测结果；2:双酶切鉴定结果；3:空白对照。具体实施例方式下面通过实验并结合实施例对本专利技术做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本专利技术的保护范围。本领域普通技术人员理解，在本专利技术权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本专利技术的保护范围内。实施例I 一种基于羊传染性脓疱病毒B2L基因的DNA疫苗载体的制备一、通过基因工程技术克隆B2L基因I、引物的设计根据B2L基因完整编码区设计一对引物，上下游引物Pl和P2分别引入BamH I(GGATCC)和 Xho T (CTCGAG)酶切位点。 上游引物PI : TTTGGATCCATGTGGCCGTTCTCCTC下游引物P2 : TTTCTCGAGTTAATTTATTGGTTTGC2、PCR 扩增 B2L 基因用引物P1，P2，在高保真DNA聚合酶作用下，以羊传染性脓疱病毒DNA为模板，扩增B2L基因。扩增条件为95°C预变性5min后进入循环，循环参数为95°C lmin,57. 5°C lmin、72°C lmin, 35个循环后72°C延伸lOmin。反应结束后于I. 0%的琼脂糖凝胶中检测大小为1137bp的扩增DNA片段。扩增结果见图2所示。3、B2L基因扩增片段的酶切及回收经电泳检测后大小合适的DNA片段和pVAXl载体(购自Invitrogen公司)各I微克，分别加入10单位的限制性内切酶BamH I和Xho I，混于50微升的反应缓冲液中，于37°C酶切I小时，经常规的琼脂糖凝胶电泳分离和胶中DNA回收方法(按J.萨姆布鲁克，D. W.拉塞尔著，黄培堂等译“分子克隆实验指南”，第三版，387-399页，404-407页2002年8月，科学出版社出版，北京)分别获得粘性末端的B2L基因片段和PVAXl质粒片段。4、B2L基因片段与pVAXl质粒片段连接将纯化后的B2L基因片段与真核表达载体pVAXl质粒片段连接，目的基因片段与质粒载体片段按摩尔比3:1混合，10 μ I反应体系如本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于羊传染性脓疱病毒B2L基因的DNA疫苗载体，其特征在于所述的疫苗载体是通过将羊传染性脓疱病毒主要免疫原性基因B2L基因插入到真核表达载体pVAX1内构建得到的。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘湘涛，张克山，刘永杰，孔汉金，尚佑军，田宏，尹双辉，逯忠新，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：
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