一种同时高效表达双基因的真核表达载体制造技术

本发明专利技术涉及一种同时高效表达两个基因的真核表达载体，将如下结构构建至同一个真核表达载体上：1）由CMV启动子调控的外源基因表达框结构，即CMV启动子+MCS1（多克隆位点1）+BGHPolyA；2）由hEF1α启动子调控的外源基因表达框结构，即hEF1α启动子+MCS2（多克隆位点2）+SV40PolyA。利用此发明专利技术，可以简单、方便地构建同时高效表达两个外源基因的真核表达载体。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种同时高效表达两个基因的真核表达载体，可以用于基因功能研究及基因治疗用途。
技术介绍
真核表达是基因功能研究中最常用的研究手段之一。在利用真核表达载体表达欲研究的外源基因时，经常会需要同时表达两个基因。例如，在表达目的基因用于研究的同时，再表达一个荧光基因，用来作为细胞转染指示，以监测该真核表达质粒转染目的细胞的效率。又或者，需要同时表达两个欲研究的目的基因，以研究这两个基因的协同作用效应。虽然，可以通过构建两个单独的真核表达载体，然后共转染至同一瓶细胞中，以实现上述目的，但是，由于两种质粒和转染试剂混合时的不均一性，以及不同质粒进入细胞效率的差异，这种共转染经常会出现较大的实验误差，而要尽量消除这种误差，则需要同时做多组平行样，计算其平均值。这样无疑大大增加了工作量和实验成本。而如果能在同一个载体上实现两个基因的同时表达，则不需要做共转染，只需要转染一个质粒即可，因此能够很好地解决上述问题。目前，在同一个载体上实现两个基因的同时表达，有几种方法，但是都有各自的缺点和不足。一种方法是，将两个基因融合在一起表达，中间间以数个氨基酸作为Linker。这种方法，两个基因的表达水平基本一致，但是缺点是，由于两个蛋白彼此融合在一起，所以有可能会互相影响彼此的空间折叠，从而导致蛋白功能下降甚至失效。例如这种载体的代表pEGFP-Nl，在EGFP前面插入另一个外源基因后，绿色荧光则往往会变弱。另一种方法，是利用IRES元件，将两个基因串联起来。两个基因在mRNA水平基本一致，而且会各自单独翻译，互不影响。但是这种方法的缺点是，IRES后面的基因表达量偏低，往往只有前面基因表达量的三分之一到二分之一。所以这种方法虽然能够实现一个载体同时表达两个基因的目的，但是其并不是高效的，其中一个基因的表达量是比较低的。因此，非常有必要开发一种新型的表达载体，能够既同时高效表达两个外源基因，且两个基因表达相对独立，不会互相影响。
技术实现思路
为实现既同时高效表达两个外源基因，且两个基因表达相对独立，不会互相影响的目的，本专利技术提供了一种双表达框载体，可以简单、方便地同时高效表达两个外源基因。将如下结构构建至同一个真核表达载体上1)由CMV启动子调控的外源基因表达框结构，即CMV启动子+MCSl (多克隆位点1)+BGH PolyA ；2)由hEFl α启动子调控的外源基因表达框结构，即hEFl α启动子+MCS2 (多克隆位点2) +SV40 PolyA。上述载体中还包括Kan原核抗性筛选标记，以及Neo真核抗性筛选标记。根据上述技术方案，本专利技术提供了一个真核表达载体，序列如SEQ NO I所示。利用本专利技术提供的真核表达载体，可以简单方便地将两个不同的外源基因分别插入两个MCS (多克隆位点)，置于CMV启动子或hEFl α启动子的调控下。由于CMV启动子是目前已知的最强真核启动子之一，而hEFl α启动子也是一个很强的启动子，所以本载体可以很好地实现两个基因的同时、高效表达。附图说明图I是本专利技术所涉及的双表达框载体pYr-adshuttle-3的质粒图谱； 图2是在pYr-adshuttle-3的两个表达框中分别插入绿色荧光基因EGFP、红色荧光基因DsRed-Monomer后，构建得到的质粒pYr-ads-3-EGFP-moRED转染293细胞后的荧光图片。A为普通视野；B为绿色视野；C为红色视野。图3是pYr-ads-3-EGFP-MY01E转染小鼠肾脏足细胞48h后的荧光图片。A为普通视野为绿色视野。图4是不同组小鼠肾脏足细胞中MYOlE的Western-blot检测结果。A为ffestern-blot检测结果；B为读取各条带灰度值后,分析所得的柱状图。图5是商业化载体pYr-adshuttle-1的质粒图谱。具体实施例方式实施例I 双表达框载体pYr-adshuttle-3的构建 方法以商业化载体pYr-adshuttle-Ι (长沙赢润生物技术有限公司生产，如SEQ NO 2所示)为骨架，通过一系列改构，构建双表达框载体pYr-adshuttle-3。(I)从pEFl/myc-His A上PCR扩增hEFl α启动子片段，两端加上酶切位点(NheIhEF-Ια ---NotIKpnIXhoIBglIIMlul)。以 NheI、MluI 为亚克隆位点，将hEFl a启动子片段亚克隆至pYr-adshuttle-1上。构建好的载体命名为pYr-ads-1-hEFlαρ。(2)从pEFl/myc-His A上PCR扩增SV40 PolyA片段，两端加上酶切位点(BglII--HindIII—SalI—SV40 PolyA—Mlul)。以 Bglll、MluI 为亚克隆位点，将SV40 PolyA片段亚克隆至pYr-ads-1-hEFl α ρ上。构建好的载体命名为pYr-ads-1-hEFlap-SV40PA。 (3)从pYr-adshuttle-1上PCR扩增CMV启动子片段，两端加上酶切位点(NheICMVpBamHIEcoRD0以Nhel、EcoRI为亚克隆位点，将CMV启动子片段亚克隆至 pYr-ads-l-hEFl a p-SV40PA 上。构建好的载体即为 pYr-adshuttle-3。结果双表达框载体pYr-adshuttle-3构建成功，图一为pYr-adshuttle-3质粒图谱，序列表中为该载体完整序列。其中，CMV启动子和hEFl α启动子后各有一个MCS (多克隆位点)，用来插入外源基因。CMV启动子后面为MCSl (多克隆位点1)，可以用于克隆构建的酶切位点有SacIBamHIEcoRIPstIXhoIPmeI ；hEFl α 启动子后面为 MCS2 (多克隆位点 2)，可以用于克隆构建的酶切位点有=KpnIBglIISalIHindII I。结论按照此方法可成功构建双表达框载体pYr-adshuttle-3。 实施例2 双表达框载体pYr-adshuttle-3的有效性验证 方法为了验证本专利技术所涉及的双表达框载体pYr-adshuttle-3是否可以正常工作，将绿色荧光基因和红色荧光基因分别构建至该载体中，然后转染细胞，观察荧光。(I)从pEGFP-Nl上扩增EGFP绿色荧光基因，两端加上Bgl 11和Hindi 11酶切位点。以BglII和HindIII为亚克隆位点，将EGFP片段亚克隆至pYr-adshuttle-3，插入hEFl α启动子后面的MCS2 (多克隆位点2)。构建好的载体命名为pYr-ads-3-EGFP。(2)从 pDsRed-Monomer-Nl 上扩增 DsRed-Monomer 红色突光基因，两端加上 BamHI和EcoRI酶切位点。以BamHI和EcoRI为亚克隆位点，将DsRed-Monomer片段亚克隆至pYr-ads-3-EGFP，插入CMV启动子后面的MCSl (多克隆位点I)。构建好的载体命名为pYr-ads-3-EGFP-moRED。(3)用Lip2000转染试剂将pYr-ads-3-EGFPioRED质粒转染至293细胞，48h后于突光显微镜下观察突光。结果PYr-ads-3-EGFP-moRED构建好后，转染至293本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种同时高效表达两个基因的真核表达载体，其特征在于，将如下结构构建至同一个真核表达载体上：1）由CMV启动子调控的外源基因表达框结构，即CMV启动子+MCS1（多克隆位点1）+BGH？PolyA；2）由hEF1α启动子调控的外源基因表达框结构，即hEF1α启动子+MCS2（多克隆位点2）+SV40？PolyA。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：易银沙，
申请(专利权)人：易银沙，
类型：发明
国别省市：