一对真核表达载体的制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一对真核表达载体的制备方法，包括：(1)获取CD14抗体重链及轻链可变区序列；(2)构建重链真核表达载体；(3)构建轻链真核表达载体。本发明专利技术还公开了该方法所制备的一对真核表达载体和通过该表达载体所制备的嵌合抗体。本发明专利技术采用了分子生物学和基因工程的办法，构建了CD14嵌合抗体基因的真核表达载体，通过诱导表达，亲和层析，获得了纯化的嵌合抗体。

Method for preparing a pair of eukaryotic expression vectors and uses thereof

The invention discloses a method for preparing a pair of eukaryotic expression vectors, comprising: (1) obtaining a sequence of CD14 antibody heavy chain and light chain variable region; (2) constructing a heavy chain eukaryotic expression vector; (3) constructing a light chain eukaryotic expression vector. The invention also discloses a pair of eukaryotic expression vectors prepared by the method and chimeric antibodies prepared by the expression vector. The invention adopts the method of molecular biology and gene engineering to construct the eukaryotic expression vector of the CD14 chimeric antibody gene, and obtains the purified chimeric antibody by inducing expression and affinity chromatography.

【技术实现步骤摘要】
一对真核表达载体的制备方法及其应用
本专利技术属于重组抗体
，具体涉及一对真核表达载体的制备方法及其应用。
技术介绍
CD14有mCD14和sCD14两种类型，是细胞表面的糖蛋白，其生物学功能主要是识别、结合LPS或LPS/LBP复合物，介导LPS所致的细胞反应，在LPS性炎症反应、内毒素休克等病理反应中起重要作用。筛选出能识别CD14分子的抗体，对研究CD14分子的功能及整个通路都具有重要作用。若能够完全封闭CD14的功能，特异性的阻断CD14与LPS及LPS/LBP复合物结合，就能够防止或中止LPS性炎症反应、内毒素休克等病理反应的发生，对于临床治疗内毒素血症、内毒素休克等也将会较好的应用前景。噬菌体展示单链抗体将抗体可变区基因片段插入到噬菌体外壳蛋白基因中，表达的抗体可变区与噬菌体外壳蛋白融合并展示于噬菌体表面，从而实现了抗体基因表现型和基因型的连接。通过对目的抗原的淘选，从抗体库中筛选出识别目的抗原的抗体，获得的抗体基因可以用于进一步改造。膜蛋白表达成本较高，常规的抗体制备方法，无论是单克隆抗体还是多克隆抗体，均需要制备大量的膜蛋白用于免疫和检测。用噬菌体展示的抗体库的筛选方法，只需要少量的抗原就可以完成筛选和检测。同时，由于膜蛋白本身结构的复杂性，外源表达的膜蛋白在构象上并不能完全模拟细胞表面的膜蛋白，导致用外源蛋白免疫的方法制备的抗体不能很好识别细胞表达的膜蛋白。用细胞直接作为抗原免疫小鼠后，小鼠的免疫系统直接识别细胞表面的膜蛋白，这个天然状态的膜蛋白诱导产生的抗体能更好地识别膜蛋白。结合噬菌体展示抗体库可以高通量筛选的优点，可以细胞免疫后的抗体库中快速筛选出识别膜蛋白的抗体。
技术实现思路
本专利技术旨在解决现有技术中存在的技术问题之一，为此，本专利技术的一个目的在于提供了一对真核表达载体的构建技术，旨在完整表达能够识别CD14蛋白的嵌合抗体。需要说明的是，本专利技术是基于专利技术人的下列发现而完成的：本专利技术的具体技术方案如下：根据本专利技术的一个方面，本专利技术提供了一对能够完整表达出完整的可识别CD14蛋白的嵌合抗体的真核表达载体，包括以下步骤：1.获取CD14抗体重链及轻链可变区序列：利用PBMC细胞免疫小鼠后，提取脾脏mRNA，设计特异性引物扩增重链和轻链可变区，构建抗体可变区文库，筛选抗体噬菌体文库，得到重链可变区基因和轻链可变区基因。2.构建重链真核表达载体：设计引物用于PCR扩增重链可变区，用限制性内切酶EcoRI和XhoI酶切位点分别对回收的PCR产物和pFUSEss-CHIg-hG1空载体进行37℃双酶切过夜，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分析回收纯化后，在T4DNA连接酶作用下16℃连接过夜。将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化液涂布于含卡那霉素的LB平板上，37℃培养过夜，次日随机挑取8个平板上单克隆菌落进行菌落PCR，筛选阳性单克隆菌落扩增提取质粒，进一步对质粒进行双酶切及测序鉴定。3.构建轻链真核表达载体：设计引物用于PCR扩增轻链可变区，用限制性内切酶AgeI和NcoI酶切位点分别对回收的PCR产物和pFUSE2ss-CLIg-hk空载体进行37℃双酶切过夜，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分析回收纯化后，在T4DNA连接酶作用下16℃连接过夜。将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化液涂布于含卡那霉素的LB平板上，37℃培养过夜，次日随机挑取8个平板上单克隆菌落进行菌落PCR，筛选阳性单克隆菌落扩增提取质粒，进一步对质粒进行双酶切及测序鉴定。4.共转染293T细胞表达CD14抗体:将获得的两种载体通过PEI转染293T细胞，获得含有重链和轻链的细胞株，通过抗生素筛选含有两种质粒的细胞株，培养细胞株，得到嵌合抗体。5.嵌合抗体的纯化1)取亲和层析柱，水洗10倍柱床体积；2)用10倍柱床体积乙酸钠缓冲液洗涤层析株；3)取细胞培养液，4℃12000rpm离心10min,收集上清，用0.45μm的滤膜过滤；4)取5mL细胞培养基上清与等量的乙酸钠缓冲液混合；5)以0.5mL/min的速度上样，收集穿透；6)上样结束后，继续以乙酸钠缓冲冲洗至G250检测无色；7)用冰乙酸洗脱缓冲冲洗柱床，搜集洗脱峰；8)迅速用饱和碳酸钠调洗脱峰pH至中性；9)若上样体积较大，边洗脱边加饱和碳酸氢钠；10)用10倍体积的超纯水洗涤1层析柱；11)用10mLNaCl-叠氮钠缓冲封闭层析柱，置于4℃备用；12)将洗脱峰超滤浓缩到血清等体积，装入透析袋。13)置于5LPBS中4℃透析过夜；14)次日换液一次(5LPBS)；15)6h后取出样品，4℃,12000rpm离心10min，收集上清，置于4℃暂存；16)取出4μL抗体，用SDS-PAGE检测抗体的纯化。17)用Nanodrop测定抗体的浓度。6.嵌合抗体的Westernblot检测1)样品制备，取THP-1细胞，去掉培养基后用PBS进行清洗，按106加入500μL上述RIPA蛋白抽提液裂解细胞，取上清。2)取匀浆液加入等体积2×上样缓冲液混匀，煮沸8min后上样，进行10％SDS-PAGE电泳分离蛋白，恒定电压140伏，电泳至溴酚蓝染料快到玻璃板边缘时；3)将变性分离蛋白条带电转移到硝酸纤维素膜(NC膜，美国Millipore产品)上，恒定电流100毫安，持续时间1h；4)取出NC膜，用4％PBSM封闭1h，PBS洗三次后，加入用4％PBSM稀释100倍后的本专利技术的可溶性单链抗体P1A8溶液，37℃保温孵育1h；5)BST和PBS分别洗膜三次，10min/次，加入PBSM稀释(1:5000)的HRP/Etagconjugate抗体，37℃保温孵育1h；6)PBST和PBS分别洗膜三次，10min/次，加入超敏ECL化学发光底物，显色拍照。结果如图1所示，本专利技术的P1A8抗体可以从THP-1细胞裂解液中特异性识别CD14蛋白。7.嵌合抗体的免疫荧光检测1)使用交联剂，4％预冷的多聚甲醛覆盖细胞，室温固定15min，避光；2)吸去多聚甲醛后，用PBS洗4遍，每次3min。3)10％正常非免疫山羊血清(PBS稀释)室温封闭30min。4)配制一抗：用5％正常山羊血清稀释一抗(P1A8)，至终浓度为0.1μg/μL；5)加入一抗液覆盖细胞，4℃孵育过夜，避光。6)取出细胞复温至室温，用PBS洗4遍，每次3min；7)配制荧光标记二抗：用5％正常山羊血清稀释二抗，稀释比例为1:300；8)加入二抗，室温孵育45min(避光)；9)吸去多余二抗，PBS洗4遍，每次3min。10)配制DAPI液：用PBS稀释DAPI原液，稀释比例为1:100；11)加入DAPI染液覆盖细胞，染色1min。结果如图2所示，本专利技术的P1A8抗体可以检测HepG2细胞细胞表面的CD14蛋白。本专利技术采用了分子生物学和基因工程的办法，构建了CD14嵌合抗体基因的真核表达载体，通过诱导表达，亲和层析，获得了纯化的嵌合抗体。本专利技术的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本专利技术的实践了解到。附图说明图1CD14嵌合抗体的Westernblot验证图2嵌合抗体IF验证具体实施方式下面详细描述本专利技术的实施例。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用本文档来自技高网...

【技术保护点】
一对真核表达载体的制备方法，其特征在于，具体包含以下步骤：(1)获取CD14抗体重链及轻链可变区序列；(2)构建重链真核表达载体；(3)构建轻链真核表达载体。

【技术特征摘要】
1.一对真核表达载体的制备方法，其特征在于，具体包含以下步骤：(1)获取CD14抗体重链及轻链可变区序列；(2)构建重链真核表达载体；(3)构建轻链真核表达载体。2.一对真核表达载体，其特征在于，根据权利要求1所述一对真核表达载体的制备方法制备而成。3.根据权利要求1所述的一对真核表达载体的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述CD14抗体为经CD14蛋白免疫小鼠获得的鼠源抗体。4.根据权利要求1所述的一对真...

【专利技术属性】
技术研发人员：华权高，沈鹤霄，马峰，罗绍祥，肖颖，舒芹，徐春雷，王静，邓陈玲，易汪雪，李昆鹏，
申请(专利权)人：武汉金开瑞生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42