一种定向敲降斑马鱼基因组中多拷贝基因的方法技术

本发明专利技术公开了一种定向敲降斑马鱼基因组中多拷贝基因的方法，包括以下步骤：步骤一：斑马鱼胚胎的制备；步骤二：dCas9‑Eve融合蛋白的表达载体构建；步骤三：进行sgRNA、dCas9‑Eve、Cas9和基因的体外转录，再将体外转录合成的sgRNA、dCas9‑Eve、Cas9mRNA和基因mRNA用RNeasy Mini Kit进行纯化；步骤四：sgRNA的活性鉴定；步骤五：dCas9‑Eve法敲降多拷贝基因znfl1s的表达，用胚胎整体原位杂交法通过检测基因的表达，判定基因表达被敲降的情况。本发明专利技术利用dCas9‑Eve的方法，在有效靶向识别基因启动子的sgRNA存在的情况下，可特异敲降基因的转录，避免了在研究基因在胚胎早期发育中受MO毒性或者脱靶导致的非特异性表型的影响，而且Eve抑制转录结构域是斑马鱼来源的，因此dCas9‑Eve可以适用于对任何斑马鱼基因在转录水平的敲降。

Method for directional knockdown of multiple copy genes in zebrafish genome

The invention discloses a directional gene knock down method of multiple copies of the zebrafish genome, including the following steps: the preparation of zebrafish embryos; step two: construct the expression vector of dCas9 Eve fusion protein; step three: sgRNA, Eve, Cas9 and dCas9 gene transcription in vitro, then in vitro transcription sgRNA, Eve, Cas9mRNA and dCas9 gene mRNA RNeasy Mini Kit was purified; step four: identification of sgRNA activity; step five: the expression of dCas9 Eve knockdown multi copy gene znfl1s, using whole mount in situ hybridization to detect the expression of genes, gene expression was determined knock down. The method of using dCas9 Eve promoter to identify genes exist, the effective target sgRNA, specific knockdown of gene transcription, avoid the effect in the study of gene in the nonspecific phenotype of early embryonic development by MO toxicity or miss lead, and Eve transcription repression domain is the source of zebrafish therefore, dCas9 Eve can be applied to any of the genes at the transcriptional level of knockdown zebrafish.

【技术实现步骤摘要】
一种定向敲降斑马鱼基因组中多拷贝基因的方法
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种定向敲降斑马鱼基因组中多拷贝基因的方法。
技术介绍
在研究基因在胚胎早期发育中的功能时，我们通常在基因的某个区域设计吗啡啉(morpholino，MO)来敲降基因的表达，但由于多拷贝基因存在剪接的不一致性，无法设计针对同样剪接位点的MO来验证该基因的功能，而且MO毒性或者脱靶常导致非特异性的表型。CRISPR/Cas9是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA，已成为一种适用于在培养细胞和整个生物体中实现定向诱变的基因组编辑工具。近年来，研究人员基于传统CRISPR/Cas9基因编辑系统构建出了一些新型的基因调控工具：用于下调基因的CRISPR干扰(CRISPRi)技术。CRISPRi是指利用缺失核酸内切酶活性的Cas9(dCas9)与单条导向RNA共表达，来产生一种DNA识别复合物,利用这种复合物特异性干扰转录延伸，RNA聚合酶结合，或转录因子结合。该技术可以通过两条sgRNA的导入实现很强的基因沉默效果。不同于传统的RNA干扰技术，CRISPRi能够同时沉默任意数量的单个基因。并且，关闭非靶向基因的风险很小。此外，与RNA干扰阻止蛋白质生成不同，CRISPRi是通过阻止DNA信息被读写为RNA来发挥作用。已有研究人员证实将Krüppelassociatedbox(KRAB)结构域与dCas9融合，在线虫和斑马鱼中可以有效地抑制靶基因(LijiangLongetal.，2015，CellResearch,25:638-641)。但是KRAB结构域在斑马鱼中未找到同源基因，亟需一种dCas9融合系统，其抑制转录的结构域在斑马鱼中存在，通过靶向特异性的sgRNAs在内源基因表达位点上或附近改变基因表达。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，运用斑马鱼来源的Eve结构域，而提出的一种定向敲降斑马鱼基因组中多拷贝基因的方法，包括以下步骤：步骤一：斑马鱼胚胎的制备；步骤二：dCas9-Eve融合蛋白的表达载体构建，将编码dCas9的cDNA序列与编码Eve的cDNA序列重组时，在二者之间置入一个linker序列；步骤三：进行sgRNA、dCas9-Eve、Cas9和基因的体外转录，再将体外转录合成的sgRNA、dCas9-Eve、Cas9mRNA和基因mRNA用RNeasyMiniKit进行纯化；步骤四：sgRNA的活性鉴定，将sgRNA和Cas9mRNA同时注射入1-细胞期斑马鱼胚胎，待胚胎发育至24hpf，收集5个胚胎，用金属镊子撕去壳膜，放入PCR管中，运用斑马鱼基因型鉴定试剂盒快速提取基因组DNA，再用可扩增出含sgRNA识别序列的基因启动子正向引物和反向引物为扩增引物、以上述提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增，之后验证PCR产物大小是否与目的片段一致，并将PCR产物进行测序，判定sgRNA是否具有活性；步骤五：dCas9-Eve法敲降znfl1s的表达，将鉴定有活性的sgRNA以终浓度50ng/μl和250ng/μldCas9-Eve进行混合，然后显微注射入1-细胞的斑马鱼胚胎，待胚胎发育至8hpf，用胚胎整体原位杂交法通过检测基因的表达，判定基因表达被敲降的情况。优选的，所述斑马鱼胚胎的制备方法包括以下步骤：将斑马鱼饲养于循环水系统中，房间温度28.5℃，每天固定光照14小时，黑暗10小时，上、下午各喂食一次，收集胚胎时，提前一天将交配用的雌鱼和雄鱼分别置于交配盒的两端，中间以隔板隔开，待第二天早上光照时，将隔板抽出，雌雄交配，收集胚胎，并将胚胎置于28.5℃的恒温培养箱中培养备用。优选的，所述所述步骤三中纯化包括如下步骤：首先向BufferRPE加入4倍体积的无核酸酶无水乙醇，然后往体外转录的mRNA样本中加入DEPC处理过的超纯水，使得体积扩大至100μl，加入350μl的RLT，混匀，再将混合液加入到RNeasyMini制备管中，将制备管放入2ml收集管中，12000g离心1分钟，丢掉滤液，加入500μlBufferRPE，12000g离心1分钟，丢掉滤液，再次加入500μlBufferRPE，12000g离心1分钟，丢掉滤液，再次12000g离心1分钟后，将制备管放入无核酸酶的EP管内，向制备管中央滴加30-50μlDEPC处理过的超纯水，12000g离心1分钟，最后用紫外分光光度计测定mRNA浓度，经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定mRNA质量后，分装并保存于-80℃。优选的，步骤四中快速提取基因组DNA的过程为：向PCR管中加入10μlA液，然后将PCR管置于PCR仪器内，经65℃15分钟、95℃5分钟、16℃1分钟完成基因组DNA提取，提取的基因组DNA置于-20℃保存备用。优选的，所述步骤五中胚胎整体原位杂交法的具体操作步骤为将胚胎用4％多聚甲醛固定，4℃过夜，第二天用尖头金属镊在解剖镜下撕去壳膜后，用25％、50％、无水乙醇梯度脱水，每次室温5分钟，脱水后的胚胎置于-20℃1小时，之后用25％PBST：75％乙醇、50％PBST：50乙醇、1×PBST梯度复水，复水后的胚胎加入预杂交液，于65℃杂交炉中放置5分钟，之后用加入酵母RNA和肝素以及RNA探针的杂交液65℃过夜，第三天，于65℃，用含50％甲酰胺、10％20×SSC和0.1％Tween的溶液洗两次，每次30分钟，之后用2×SSCT洗一次15分钟，再用0.2×SSCT洗两次，每次30分钟，再用pH7.5的MABT室温洗3次，每次5分钟，之后用封闭液室温封闭1小时后换入含有1/2000-1/5000稀释的地高辛抗体的封闭液，4℃过夜，第四天，用MABT洗八次，室温，每次30分钟，之后显色，并先加入平衡液，室温放置10分钟之后，吸出平衡液，换入显色液，避光，室温放置6-8小时，显色完全后，用PBST清洗一遍，室温5分钟，用无水乙醇清洗两遍，室温10分钟，加入包埋液(2:1混合的Bezylbenzoate和Benzylalcohol)，原位杂交结果用莱卡MZ16F立体显微镜拍照记录，图像用AdobePhotoshopCS5Extended软件进行对比度和光强度处理。优选的，所述预杂交液为50％去离子甲酰胺、25％20×SSC和0.1％Tween的混合液。优选的，所述封闭液为2％Blockingregent、10％绵羊血清，70％MAB和0.1％Tween的混合液。优选的，所述平衡液为0.1MNaCl、0.1MTris-HCl(PH＝9.5)、0.05MMgCl2、0.1％Tween-20和0.5mg/mlLavamisol的混合液。优选的，所述包埋液为2:1混合的Bezylbenzoate和Benzylalcohol。本专利技术提供的一种定向敲降斑马鱼基因组中多拷贝基因的方法，利用dCas9-Eve的方法特异敲降基因的转录，根据果蝇中的Eve抑制功能域，找到同源的斑马鱼Eve功能域，将dCas9和斑马鱼的Eve抑制功能域做融合蛋白，可以有效靶向识别基因启动子的sgRNA存在的情况，同时Eve和dCas9结合在一起后的dCas9-Eve可显著抑制任何斑马鱼基因的表达，适用范围广，而且本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种定向敲降斑马鱼基因组中多拷贝基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：斑马鱼胚胎的制备；步骤二：dCas9‑Eve融合蛋白的表达载体构建，将编码dCas9的cDNA序列与编码Eve的cDNA序列重组时，在二者之间置入一个linker序列；步骤三：进行sgRNA、dCas9‑Eve、Cas9和基因的体外转录，再将体外转录合成的sgRNA、dCas9‑Eve、Cas9mRNA和基因mRNA用RNeasy Mini Kit进行纯化；步骤四：sgRNA的活性鉴定，将sgRNA和Cas9mRNA同时注射入1‑细胞期斑马鱼胚胎，待胚胎发育至24hpf，收集5个胚胎，用金属镊子撕去壳膜，放入PCR管中，运用斑马鱼基因型鉴定试剂盒快速提取基因组DNA，再用可扩增出含sgRNA识别序列的基因启动子正向引物和反向引物为扩增引物、以上述提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增，之后验证PCR产物大小是否与目的片段一致，并将PCR产物进行测序，判定sgRNA是否具有活性；步骤五：dCas9‑Eve法敲降znfl1s的表达，将鉴定有活性的sgRNA以终浓度50ng/μl和250ng/μl dCas9‑Eve进行混合，然后显微注射入1‑细胞的斑马鱼胚胎，待胚胎发育至8hpf，用胚胎整体原位杂交法通过检测基因的表达，判定基因表达被敲降的情况。...

【技术特征摘要】
1.一种定向敲降斑马鱼基因组中多拷贝基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：斑马鱼胚胎的制备；步骤二：dCas9-Eve融合蛋白的表达载体构建，将编码dCas9的cDNA序列与编码Eve的cDNA序列重组时，在二者之间置入一个linker序列；步骤三：进行sgRNA、dCas9-Eve、Cas9和基因的体外转录，再将体外转录合成的sgRNA、dCas9-Eve、Cas9mRNA和基因mRNA用RNeasyMiniKit进行纯化；步骤四：sgRNA的活性鉴定，将sgRNA和Cas9mRNA同时注射入1-细胞期斑马鱼胚胎，待胚胎发育至24hpf，收集5个胚胎，用金属镊子撕去壳膜，放入PCR管中，运用斑马鱼基因型鉴定试剂盒快速提取基因组DNA，再用可扩增出含sgRNA识别序列的基因启动子正向引物和反向引物为扩增引物、以上述提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增，之后验证PCR产物大小是否与目的片段一致，并将PCR产物进行测序，判定sgRNA是否具有活性；步骤五：dCas9-Eve法敲降znfl1s的表达，将鉴定有活性的sgRNA以终浓度50ng/μl和250ng/μldCas9-Eve进行混合，然后显微注射入1-细胞的斑马鱼胚胎，待胚胎发育至8hpf，用胚胎整体原位杂交法通过检测基因的表达，判定基因表达被敲降的情况。2.根据权利要求1所述的一种定向敲降斑马鱼基因组中多拷贝基因的方法，其特征在于，所述斑马鱼胚胎的制备方法包括以下步骤：将斑马鱼饲养于循环水系统中，房间温度28.5℃，每天固定光照14小时，黑暗10小时，上、下午各喂食一次，收集胚胎时，提前一天将交配用的雌鱼和雄鱼分别置于交配盒的两端，中间以隔板隔开，待第二天早上光照时，将隔板抽出，雌雄交配，收集胚胎，并将胚胎置于28.5℃的恒温培养箱中培养备用。3.根据权利要求1所述的一种定向敲降斑马鱼基因组中多拷贝基因的方法，其特征在于，所述步骤三中纯化包括如下步骤：首先向BufferRPE加入无核酸酶无水乙醇，然后往体外转录的mRNA样本中加入DEPC处理过的超纯水，使得体积扩大至100μl，加入350μl的RLT，混匀，再将混合液加入到RNeasyMini制备管中，将制备管放入收集管中，离心并丢掉滤液，加入BufferRPE，离心并丢掉滤液，再次加入BufferRPE，离心并丢掉滤液，再次离心后，将制备管放入无核酸酶的EP管内，向制备管中...

【专利技术属性】
技术研发人员：李俊，赵庆顺，李景云，顾淳，董晓华，
申请(专利权)人：南京市妇幼保健院，南京大学，南京尧顺禹生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32