一种基因片段，其包括（１）金色斑马鱼的α－肌动蛋白基因启动子；（２）荧光基因；（３）腺相关病毒的反向末端重复ＩＴＲ；和（４）来自ｐＵＣ的一基础部分。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种生产新的转基因金色斑马鱼(golden zebra danio)的方法。本专利技术也涉及新的基因片段和新的转基因金色斑马鱼。
技术介绍
装饰类鱼是水产生意的一部分，它属于有着全球化产业的娱乐工业。因此，利用重组DNA和转基因技术来改良装饰类鱼能带来好的经济效益。然而，传统的转基因技术只能生产表达发射镶嵌性的或弱的荧光的转基因鱼。这些鱼只能在具有特定波长的荧光显微镜下被发现。归咎于其不具实用性以及各种困难，先前的荧光鱼鱼种不能被消费者很好地接受且不具有装饰鱼的商业价值。
技术实现思路
本专利技术的目的是将重组DNA技术应用于商品化可获得的质粒构建体，如来自Clontech的pDsRed2-1以及p-αEGFPITR，来建立带有需要的转基因的幼苗的稳定来源。本专利技术的另一个目的涉及基因片段，其包括(1)金色斑马鱼的α-肌动蛋白基因启动子；(2)荧光基因；(3)腺相关病毒的反向末端重复；和(4)来自pUC的一基础部分，该基因片段可产生一种骨骼肌肉发射红色荧光的新的金色斑马鱼鱼种。本专利技术的另一个目的还涉及一种基因工程方法，其可产生带有荧光转基因并在其全身的骨骼肌中表达荧光蛋白的新的金色斑马鱼。附图说明图1说明了质粒构建体p-αEGFPITR及其限制性酶切位点。图2说明了质粒构建体pDsRedITR及其限制性酶切位点。图3说明了质粒构建体p-αDsRedITR及其插入的基因片段和限制性酶切位点。图4是DNA片段p-αDsRedITR和限制性酶切位点的线性图示。图5是DNA片段p-αEGFPITR和限制性酶切位点的线性图示。图6是成功地转染了本专利技术的DNA三天后的金色斑马鱼胚胎(F1代)的照片，显示出红色荧光的表达。照片暴光时间为1/4秒。图7是成功地转染了本专利技术的DNA三天后的金色斑马鱼胚胎(F1代)的照片，显示出绿色荧光的表达。照片暴光时间为2秒。图8显示了新的金色斑马鱼(带有p-αDsRedITR转基因)在不同世代(F0、F1、和F2代)的遗传/表达率。具体实施例方式为了避免现有技术的缺点，本专利技术的设计十分充分和严格，并有着概念上的突破。也就是说，金色斑马鱼的α-肌动蛋白基因启动子被引入如pDsRedITR，以得到新的质粒构建体p-αDsRedITR。然后，p-αDsRedITR被微注射到金色斑马鱼的受精的卵(第一次分裂前)的细胞浆中。这些卵将被用于筛选带有表达于鱼全身的骨骼肌的荧光转基因的后代。带有荧光转基因的后代将被用于进一步的繁殖。与其他已有的方法相比，本专利技术的方法具有以下五个方面的提高1.主要材料构建体是质粒构建体p-αEGFPITR和如pDsRedITR，它们有着稳定和经济的来源。2.新的DNA片段能使得金色斑马鱼全身的骨骼肌发射荧光。3.微注射进受精卵的新的DNA片段能使金色斑马鱼全身骨骼肌发射更高比例和更高质量的荧光。4.异源的转基因能被稳定地传递到下一代，因此能够应用经济而天然的繁殖方法。5.在新的突变的金色斑马鱼鱼种，它的体内骨骼肌将发射一种荧光，容易被肉眼看见。在更短波长的光源下，鱼的红色荧光将被强化产生特殊的特征和美感。这将增加装饰鱼的附加价值。本专利技术使用的荧光基因可以是红色荧光基因如DsRed，它能从Clontech的pDsRed2-1中获得，或者能是绿色荧光基因如GFP，它能从Amersham Bioscience购得。如上所说，本专利技术提供了一种生产带有体内荧光得金色斑马鱼的方法，其包括(a)构建质粒，其从上游到下游包括ITR、CMV启动子、荧光基因、S40 polyA(聚腺苷酸)和ITR；(b)用金色斑马鱼的α-肌动蛋白基因启动子(全身骨骼肌肌动蛋白基因表达)取代CMV启动子形成一个新的质粒构建体；(c)线性化此新的质粒构建体；(d)将此线性化的质粒构建体微注射到金色斑马鱼的受精卵中；(e)选择具有荧光的卵；以及(f)培育卵以产生带有全身荧光的金色斑马鱼。线性化的质粒优选地选自如图4所示的p-αDsRedITR(8.0千碱基对)或如图5所示的p-αEGFPITR(8.1千碱基对)本专利技术的方法中使用的优选的荧光基因是来自pDsRed2-1的红色荧光基因或来自pEGFP-1的绿色荧光基因。本专利技术也提供了从专利技术的方法中生产的全身带有荧光的金色斑马鱼。优选的金色斑马鱼全身有着红色或绿色荧光。实施例以下的实施例是非限制性的且仅仅是本专利技术的不同方面和特点的代表。生产带有红色荧光的金色斑马鱼的方法1.选择一种商品化可获得的质粒构建体pDsRed2-1以及p-αEGFPITR作为基础材料。质粒构建体pDsRed2-1能购自Clontech。质粒构建体p-αEGFPITR能根据相关的文献的描述(如“在F0代转基因鳉鱼(medaka，学名Oryzias latipes)中的恒定的GFP表达”，Chi-Yuan Chou等，转基因研究10303-315，2001)生产。2.从质粒pDsRED2-1中剪切出DsRed片段。然后，如图2所描述的，CMV启动子和两个腺相关病毒的反向末端重复(ITR)被连接到DsRed片段生成质粒构建体pDsRedITR。质粒构建体pDsRedITR获得了更大程度的表达稳定性。3.新的质粒构建体p-αDsRedITR的形成如图1描述的，通过用限制酶Nco I和Sal I消化的途径可以从质粒构建体p-αEGFPITR中获得金色斑马鱼的α-肌动蛋白基因启动子。Nco I首先被用于消化质粒构建体，补平酶切末端，继而用Sal I完全消化获得3.86千碱基对的片段。如图2描述的，通过用限制酶Bam HI和Sal I消化，将CMV启动子从质粒构建体pDsRedITR中剪切。Bam HI被首先用于消化质粒构建体，补平酶切末端，继而用Sal I完全消化获得4.2千碱基对的片段。然后，金色斑马鱼的α-肌动蛋白基因启动子(全身骨骼肌肌动蛋白基因表达)在CMV启动子被剪切的位点被连接于质粒构建体pDsRedITR。获得的质粒构建体有着两个145碱基对的腺相关病毒的反向末端重复(ITR)。一个ITR是位于SV 40 poly A的3’末端。另一个是位于α-肌动蛋白基因启动子的5’末端。如图3描述的，制备得到了全长为8.0干碱基对的质粒构建体p-αDsRedITR。质粒构建体p-αDsRedITR具有(1)金色斑马鱼α-肌动蛋白基因启动子(全身基因表达)；(2)海珊瑚红色荧光蛋白；(3)腺相关病毒的反向末端重复；和(4)pUC质粒构建体基础。质粒构建体p-αDsRedITR被引入大肠杆菌5α以被大量的无性生产。4.质粒构建体的线性化如图4描述的，来自p-αDsRedITR的适量的DNA被相应比例量的Not I限制酶所消化，少量的消化产物用于琼脂糖凝胶电泳分析，以确定其线性，所需的片段长度确实的8千碱基对。然后，消化的DNA产物被用相同体积的苯酚∶氯仿(1∶1)溶液提取，用乙醇沉淀，空气干燥，然后按10μg/ml浓度溶解在PBS中，以备用于细胞浆的微注射。5.细胞浆的微注射a.收集受精卵在微注射前夜的11pm，且在孵育器进入暗周期前，鱼被收集在盒状的空间，用分离网分开。在下一个早晨和亮周期开始后，每15-20分钟收集鱼卵。每次微注射期间，30-40个卵被注射，和在每个试验中，250-3本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：蔡怀桢，
申请(专利权)人：邰港科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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