本发明专利技术公开了一种基因敲除选育wnt16基因缺失型斑马鱼的方法，与现有技术相比，本发明专利技术能更高效且更精确地在生物体基因组中沉默特定基因，且制作简单、成本低，且可同时对靶基因上多个位点进行剪切，沉默任意数目的单个基因。用于进行基因与骨骼发育的相关研究，也可进项其他方面探索研究，检测wnt16基因的缺失与其他器官的发育是否具有相关性，例如心脏具有很好的医学研究价值，同时敲除wnt16基因的斑马鱼其成长周期明显缩短，也具有很好的商业价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因敲除
，尤其涉及一种基因敲除选育wnt16基因缺失型斑马鱼的方法。
技术介绍
Wnt基因位于人类12q13，是编码356个氨基酸的转录因子。一般认为Wnt信号转导途径分为经典Wnt信号途径和非经典的Wnt信号途径。经典W nt信号途径也称为Wnt/p-catenin信号途径。在不同物种中Wnt/p-catenin信号转导的分子机制具有极高的保守性。Wnt16是非经典的wnt配体，一般认为该基因介导β-catenin信号通路，可负调节RANK信号抑制破骨细胞的形成，参与骨形成和骨吸收等过程。通过基因差异表达谱分析和基因组关联分析等，发现Wnt16基因是骨骼的一个重要的调节因子，与骨质疏松密切相关。斑马鱼与人类在骨骼发育过程中的基因、信号通路有高度同源性，且wnt16基因进化上较为保守,在人类中，存在可变剪切体，wnt16基因有两个亚型wnt16a和wnt16b。而且，与其他动物模型相比，斑马鱼个体小、幼鱼通体透明，利于骨骼发育的观察。通过CRISPR/Cas9基因打靶技术，在斑马鱼wnt16基因上设计合适的打靶位点，将体外合成的特异性sgRNA(终浓度30ng/μL)和Cas9-mRNA(终浓度500ng/μL)显微共注射进斑马鱼一细胞内，并通过活性检测证实了所选位点的有效性。基因打靶技术起源于20世纪80年代末，是一种通过对基因组进行定点修饰来研究基因功能的重要的方法手段，也可用于治疗人类的各种遗传性疾病。该技术主要是利用缺失突变、基因灭活、染色体大片段删除以及外源基因导入等方式来改变生物的遗传信息，并且在生殖系中稳定遗传后表达突变性状，从而研究生物体内特定基因在生长发育过程中的作用，所以这类技术手段已成为现代分子生物学研究热点。传统的基因打靶技术是建立在胚胎干细胞(ESC)和同源重组技术的基础之上，故打靶技术效率极低。2013年初，一种全新的人工核酸内切酶clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)9，能更高效且更精确地在生物体基因组中沉默特定基因，且制作简单、成本低，且可同时对靶基因上多个位点进行剪切，沉默任意数目的单个基因，但同时该技术存在一定的缺陷，其脱靶率相对较高。
技术实现思路
本专利技术的目的就在于为了解决上述问题而提供一种基因敲除选育wnt16基因缺失型斑马鱼的方法。本专利技术通过以下技术方案来实现上述目的：本专利技术包括以下步骤：步骤一：CRISPR/Cas9基因敲除靶位点设计在GenBankTM、Ensembl或UCSC数据库上查询斑马鱼wnt16基因的基因组DNA序列及其功能结构域，根据CRISPR/Cas敲除原理，设计一对wnt16基因的靶位点，靶点的选择必须遵循5’-20bp-NGG-3’标准：其中5’端的GG二核苷酸是T7启动子的一部分，设计靶位点时不受此限制，但是必须保证靶位点的3’端是NGG，靶点的选择必须确保靶点位置碱基的插入或者缺失可以影响wnt16基因的整个结构域，从而改变基因的表达，两对特异性PCR引物如下：F1(靶位点a正向引物)：tgTAATACGACTCACTATAgacacaagcctgttgggcagGTTTTAGAGCTAGAAATAGCF2(靶位点b正向引物)：tgTAATACGACTCACTATAggcctcctcaccacgggtcgGTTTTAGAGCTAGAAATAGCR(共用的反向引物)：AAGCACCGACTCGGTGCCACT步骤二：构建gRNA表达载体以及gRNA体外合成：首先将gRNA骨架克隆到p42250载体上，取1-2μL质粒进行琼脂糖凝胶电泳检测；特异性gRNA体外合成：用BsaI限制性内切酶线性化此质粒，一般来说，酶切反应总体积为20μL，体系如下：离心混匀后于37℃水浴，酶切4h以上，以线性化的p42250载体为模板，通过下面特异性引物进行PCR，扩增出用于特异性gRNA合成的双链DNA，>PCR引物PCR引物上下游引物分别位于3号外显子两端的内含子上：F(5’-AGAAATCTCTCAGCCAAACACG-3’)R(5’-ATACTGCGAACAATTCCTTGCT-3’)正向引物F：T7启动子+20bp靶序列+gRNA上游序列反向引物R：gRNA下游序列PCR反应体系(25μL)如下：震荡混匀之后，4℃离心，于PCR仪上进行扩增反应，反应条件为：预变性95℃8min，(变性95℃30s，退火64℃30s，延伸72℃20s)30个循环，再72℃10min，待PCR扩增完成后，取1μL样品点样于2.0％琼脂糖凝胶上进行电泳，凝胶成像系统拍摄结果；检测确定条带正确之后，进行琼脂糖凝胶DNA回收，纯化回收PCR产物，测定纯化之后的DNA浓度(尽量达到1μg)，再以此DNA为模板，用20μL体系进行体外转录，合成特异性gRNA，转录实验中所用Tip头，EP管均为DEPC处理过的RNase-Free产品，具体操作如下：体外转录反应体系(20μL)：将反应物都加入1.5mL RNase-Free的EP管中，混匀之后，于37℃水浴1.5h；水浴结束后，取1μL样品，用配制好的2.0％的琼脂糖凝胶进行电泳，以检测转录结果，若转录产物大小与预期的相符，则说明转录成功；向转录体系中加入1μL DNA酶，放置于37℃水浴锅中反应20min，用以消化DNA模板，再取1μL转录终产物，即gRNA进行琼脂糖凝胶电泳，以检测转录效率，特异性gRNA的纯化：用RNeasy Mini kit试剂盒纯化转录成功的gRNA，保存于-20℃，吸取1μL溶液进行琼脂糖凝胶电泳，以检验纯化产物，并测定纯化之后的gRNA浓度，步骤三：斑马鱼胚胎的显微注射：尽量在受精后30min之内，用吸管吸取胚胎转移至用琼脂糖制作的显微注射专用培养皿中，在进行显微注射之前，将Cas9mRNA和gRNA配成混合液，充分混匀，使Cas9mRNA的终浓度为500ng/μL，gRNA的终浓度为30ng/μL，注射约1.8nL Cas9mRNA和gRNA混合液于0-1个细胞水平的受精卵内，注射过的受精卵放置于E3水(5mmol/L NaCl，0.33mmol/L CaCl2，0.33mmol/L MgSO4，0.17mmol/L KCl，)中，28℃孵化，在体式显微镜下观察胚胎表型，筛选正常发育的胚胎用于靶位点突变分析，显微注射体系如下：步骤四：T7E1法和Sanger测序检测靶位点的有效性：对斑马鱼胚胎进行显微注射之后，挑选部分发育正常的早期胚胎，检测其wnt16基因是否存在突变，可以提前确认此次选择的靶位点是否有效果，显微注射操作是否规范；步骤五：注射两个月之后，进行剪尾鉴定，同上鉴定步骤，步骤六：目的序列的TA克隆T7E1酶切初步鉴定有突变可能的目的序列再进行Sanger测序，若测序峰图有双峰，并且测序结果显示有插入或缺失现象的目的序列，接下来进行TA克隆之后挑取单克隆作进一步检测；步骤七：质粒的Sanger测序：将双酶切检测结果显示条带大小符合预期结果的质粒送往测序，根据测序之后给出的峰图和序列，在N本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基因敲除选育wnt16基因缺失型斑马鱼的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：CRISPR/Cas9基因敲除靶位点设计在GenBankTM、Ensembl或UCSC数据库上查询斑马鱼wnt16基因的基因组DNA序列及其功能结构域，根据CRISPR/Cas敲除原理，设计一对wnt16基因的靶位点，靶点的选择必须遵循5’‑20bp‑NGG‑3’标准：其中5’端的GG二核苷酸是T7启动子的一部分，设计靶位点时不受此限制，但是必须保证靶位点的3’端是NGG，靶点的选择必须确保靶点位置碱基的插入或者缺失可以影响wnt16基因的整个结构域，从而改变基因的表达，两对特异性PCR引物如下：F1(靶位点a正向引物)：tgTAATACGACTCACTATAgacacaagcctgttgggcagGTTTTAGAGCTAGAAATAGCF2(靶位点b正向引物)：tgTAATACGACTCACTATAggcctcctcaccacgggtcgGTTTTAGAGCTAGAAATAGCR(共用的反向引物)：AAGCACCGACTCGGTGCCACT步骤二：构建gRNA表达载体以及gRNA体外合成：首先将gRNA骨架克隆到p42250载体上，取1‑2μL质粒进行琼脂糖凝胶电泳检测；特异性gRNA体外合成：用BsaI限制性内切酶线性化此质粒，一般来说，酶切反应总体积为20μL，体系如下：离心混匀后于37℃水浴，酶切4h以上，以线性化的p42250载体为模板，通过下面特异性引物进行PCR，扩增出用于特异性gRNA合成的双链DNA，>PCR引物PCR引物上下游引物分别位于3号外显子两端的内含子上：F(5’‑AGAAATCTCTCAGCCAAACACG‑3’)R(5’‑ATACTGCGAACAATTCCTTGCT‑3’)正向引物F：T7启动子+20bp靶序列+gRNA上游序列反向引物R：gRNA下游序列PCR反应体系(25μL)如下：震荡混匀之后，4℃离心，于PCR仪上进行扩增反应，反应条件为：预变性95℃8min，(变性95℃30s，退火64℃30s，延伸72℃20s)30个循环，再72℃10min，待PCR扩增完成后，取1μL样品点样于2.0％琼脂糖凝胶上进行电泳，凝胶成像系统拍摄结果；检测确定条带正确之后，进行琼脂糖凝胶DNA回收，纯化回收PCR产物，测定纯化之后的DNA浓度(尽量达到1μg)，再以此DNA为模板，用20μL体系进行体外转录，合成特异性gRNA，转录实验中所用Tip头，EP管均为DEPC处理过的RNase‑Free产品，具体操作如下：体外转录反应体系(20μL)：将反应物都加入1.5mL RNase‑Free的EP管中，混匀之后，于37℃水浴1.5h；水浴结束后，取1μL样品，用配制好的2.0％的琼脂糖凝胶进行电泳，以检测转录结果，若转录产物大小与预期的相符，则说明转录成功；向转录体系中加入1μL DNA酶，放置于37℃水浴锅中反应20min，用以消化DNA模板，再取1μL转录终产物，即gRNA进行琼脂糖凝胶电泳，以检测转录效率，特异性gRNA的纯化：用RNeasy Mini kit试剂盒纯化转录成功的gRNA，保存于‑20℃，吸取1μL溶液进行琼脂糖凝胶电泳，以检验纯化产物，并测定纯化之后的gRNA浓度，步骤三：斑马鱼胚胎的显微注射：尽量在受精后30min之内，用吸管吸取胚胎转移至用琼脂糖制作的显微注射专用培养皿中，在进行显微注射之前，将Cas9mRNA和gRNA配成混合液，充分混匀，使Cas9mRNA的终浓度为500ng/μL，gRNA的终浓度为30ng/μL，注射约1.8nL Cas9mRNA和gRNA混合液于0‑1个细胞水平的受精卵内，注射过的受精卵放置于E3水(5mmol/L NaCl，0.33mmol/L CaCl2，0.33mmol/L MgSO4，0.17mmol/L KCl，)中，28℃孵化，在体式显微镜下观察胚胎表型，筛选正常发育的胚胎用于靶位点突变分析，显微注射体系如下：步骤四：T7E1法和Sanger测序检测靶位点的有效性：对斑马鱼胚胎进行显微注射之后，挑选部分发育正常的早期胚胎，检测其wnt16基因是否存在突变，可以提前确认此次选择的靶位点是否有效果，显微注射操作是否规范；步骤五：注射两个月之后，进行剪尾鉴定，同上鉴定步骤，步骤六：目的序列的TA克隆T7E1酶切初步鉴定有突变可能的目的序列再进行Sanger测序，若测序峰图有双峰，并且测序结果显示有插入或缺失现象的目的序列，接下来进行TA克隆之后挑取单克隆作进一步检测；步骤七：质粒的Sanger测序：将双酶切检测结果显示条带大小符合预期结果的质粒送往测序，根据测序之后给出的峰图和序列，在NCBI上与标准目的序列进行对比，根据比对结果，分析出每个单克隆的突变类...
【技术特征摘要】
1.一种基因敲除选育wnt16基因缺失型斑马鱼的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：CRISPR/Cas9基因敲除靶位点设计在GenBankTM、Ensembl或UCSC数据库上查询斑马鱼wnt16基因的基因组DNA序列及其功能结构域，根据CRISPR/Cas敲除原理，设计一对wnt16基因的靶位点，靶点的选择必须遵循5’-20bp-NGG-3’标准：其中5’端的GG二核苷酸是T7启动子的一部分，设计靶位点时不受此限制，但是必须保证靶位点的3’端是NGG，靶点的选择必须确保靶点位置碱基的插入或者缺失可以影响wnt16基因的整个结构域，从而改变基因的表达，两对特异性PCR引物如下：F1(靶位点a正向引物)：tgTAATACGACTCACTATAgacacaagcctgttgggcagGTTTTAGAGCTAGAAATAGCF2(靶位点b正向引物)：tgTAATACGACTCACTATAggcctcctcaccacgggtcgGTTTTAGAGCTAGAAATAGCR(共用的反向引物)：AAGCACCGACTCGGTGCCACT步骤二：构建gRNA表达载体以及gRNA体外合成：首先将gRNA骨架克隆到p42250载体上，取1-2μL质粒进行琼脂糖凝胶电泳检测；特异性gRNA体外合成：用BsaI限制性内切酶线性化此质粒，一般来说，酶切反应总体积为20μL，体系如下：离心混匀后于37℃水浴，酶切4h以上，以线性化的p42250载体为模板，通过下面特异性引物进行PCR，扩增出用于特异性gRNA合成的双链DNA，>PCR引物PCR引物上下游引物分别位于3号外显子两端的内含子上：F(5’-AGAAATCTCTCAGCCAAACACG-3’)R(5’-ATACTGCGAACAATTCCTTGCT-3’)正向引物F：T7启动子+20bp靶序列+gRNA上游序列反向引物R：gRNA下游序列PCR反应体系(25μL)如下：震荡混匀之后，4℃离心，于PCR仪上进行扩增反应，反应条件为：预变性95℃8min，(变性95℃30s，退火64℃30s，延伸72℃20s)30个循环，再72℃10min，待PCR扩增完成后，取1μL样品点样于2.0％琼脂糖凝胶上进行电泳，凝胶成像系统拍摄结果；检测确定条带正确之后，进行琼脂糖凝胶DNA回收，纯化回收PCR产物，测定纯化之后的DNA浓度(尽量达到1μg)，再以此DNA为模板，用20μL体系进行体外转录，合成特异性gRNA，转录实验中所用Tip头，EP管均为DEPC处理过的RNase-Free产品，具体操作如下：体外转录反应体系(20μL)：将反应物都加入1.5mL RNase-Free的EP管中，混匀之后，于37℃水浴1.5h；水浴结束后，取1μL样品，用配制好的2.0％的琼脂糖凝胶进行电泳，以检测转录结果，若转录产物大小与预期的相符，则说明转录成功；向转录体系中加入1μL DNA酶，放置于37℃水浴锅中反应20min，用以消化DNA模板，再取1μL转录终产物，即gRNA进行琼脂糖凝胶电泳，以检测转录效率，特异性gRNA的纯化：用RNeasy Mini kit试剂盒纯化转录成功的gRNA，保存于-20℃，吸取1μL溶液进行琼脂糖凝胶电泳，以检验纯化产物，并测定纯化之后的gRNA浓度，步骤三：斑马鱼胚胎的显微注射：尽量在受精后30min之内，用吸管吸取胚胎转移至用琼脂糖制作的显微注射专用培养皿中，在进行显微注射之前，将Cas9mRNA和gRNA配成混合液，充分混匀，使Cas9mRNA的终浓度为500ng/μL，gRNA的终浓度为30ng/μL，注射约1.8nL Cas9mRNA和gRNA混合液于0-1个细胞水平的受精卵内，注射过的受精卵放置于E3水(5mmol/L NaCl，0.33mmol/L CaCl2，0.33mmol/L MgSO4，0.17mmol/L KCl，)中，28℃孵化，在体式显微镜下观察胚胎表型，筛选正常发育的胚胎用于靶位点突变分析，显微注射体系如下：步骤四：T7E1法和Sanger测序检测靶位点的有效性：对斑马鱼胚胎进行显微注射之后，挑选部分发育正常的早期胚胎，检测其wnt1...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈湘定，刘薇薇，苏幸，邵梦思，邓云，谭丽君，邓红文，
申请(专利权)人：湖南师范大学，
类型：发明
国别省市：湖南;43
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