一种获得全肾表达绿色荧光蛋白斑马鱼的方法技术

本发明专利技术公开了一种获得全肾表达绿色荧光蛋白斑马鱼的方法。针对现有斑马鱼品系的绿色荧光蛋白不能在整个原肾小球、小管和导管中同时、均匀表达的缺陷，本发明专利技术提供了一种获得绿色荧光蛋白在原肾小球、原肾小管和原肾导管中同时表达的斑马鱼的方法。本方法是以Na,K-ATPase?alpha1A4:GFP品系斑马鱼与wt1b:GFP品系斑马鱼互为亲本的杂交育种方法。本发明专利技术方法依照杂交亲本选育、配组繁殖、杂交性状筛选、杂交子代培育、杂交性状固定与保留几个步骤加以实施。本发明专利技术方法是一种分离元件杂交稳定整合的方法，实施过程简单易控，能够获得绿色荧光蛋白在原肾小球、原肾小管与原肾导管中同时且均匀高效表达的斑马鱼品系，产品可以满足对斑马鱼原肾功能研究的整体性与完整性要求。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了。针对现有斑马鱼品系的绿色荧光蛋白不能在整个原肾小球、小管和导管中同时、均匀表达的缺陷，本专利技术提供了一种获得绿色荧光蛋白在原肾小球、原肾小管和原肾导管中同时表达的斑马鱼的方法。本方法是以Na,K-ATPase?alpha1A4:GFP品系斑马鱼与wt1b:GFP品系斑马鱼互为亲本的杂交育种方法。本专利技术方法依照杂交亲本选育、配组繁殖、杂交性状筛选、杂交子代培育、杂交性状固定与保留几个步骤加以实施。本专利技术方法是一种分离元件杂交稳定整合的方法，实施过程简单易控，能够获得绿色荧光蛋白在原肾小球、原肾小管与原肾导管中同时且均匀高效表达的斑马鱼品系，产品可以满足对斑马鱼原肾功能研究的整体性与完整性要求。【专利说明】—种获得全肾表达绿色荧光蛋白斑马鱼的方法
本专利技术涉及一种斑马鱼育种方法，特别是涉及一种获得全肾表达绿色荧光蛋白斑马鱼的育种方法，属于生物
。
技术介绍
1962年，Shimomura等首次在维多利亚多管水母(Aequoria victoria)中发现了生物发光蛋白质即水母蛋白(aequorin)，并观察到一种在紫外线照射下发浅绿色荧光的副产物-绿色突光蛋白(Green Fluorescent Protein, GFP)。1974 年，Shimomura 等完成了GFP纯化，18年后Prasher等克隆出其基因，之后1994年Chalfie等在大肠杆菌细胞和秀丽隐杆线虫中实现了 GFP的表达。GFP作为一种重要的生物标记蛋白，能够自身催化形成发色结构并在紫外或蓝光激发下发出绿色荧光。由于GFP具备荧光稳定、安全无毒害、易于检测和易于得到突变体等众多优势，从而被广泛应用于细胞生物学、分子生物学和微生物等研究领域。斑马鱼原肾的发育与人类基本一致，其肾单位或肾小球的细胞组成极其相似，且具有结构简单的优势，因此研究者经常将斑马鱼作为理想的模式生物来研究人类肾脏发育与功能。斑马鱼的原肾由2个肾单位组成，2个肾小管分别将位于两侧的前肾导管和融合在一起的肾小球相连，前肾导管在尾部汇合连通至泄殖腔。受精后2~3天，斑马鱼胚胎中已具有能够完成渗透调节功能的原肾结构。为了更好地研究斑马鱼肾脏发育过程，研制GFP肾脏特异性表达的斑马鱼品系具有重要意义。2007年，Yan Liu等人制作出Na，K-ATPasealphalA4:GFP转基因品系斑马鱼，实现了 GFP在斑马鱼原肾小管和原肾导管中的特异性表达，但是在该品系斑马鱼的原肾小球中并没有特异绿色荧光表达。同年，Perner等利用转基因技术研制出wtlb:GFP品系斑马鱼。在该转基因斑马鱼品系受精后35h，能够观察到其原肾小球和近端部分的原肾导管中发出`绿色荧光，但是在远端导管不能观察到特异的GFP表达。将上述两种品系斑马鱼用于原肾研究时，GFP不能在整个原肾小球、小管和导管中同时均匀地表达，从而影响了斑马鱼原肾功能研究的整体性和完整性。
技术实现思路
本专利技术的目的就是针对现有技术的不足，提供了一种获得绿色荧光蛋白在原肾小球、原肾小管和原肾导管中同时表达的斑马鱼的方法。为实现上述目的，本专利技术的技术方案如下:，其特征在于:是以Na，K-ATPasealphalA4:GFP品系斑马鱼与wtlb:GFP品系斑马鱼互为亲本的杂交育种方法。Na, K-ATPase alphalA4:GFP品系斑马鱼是一种经由人工培育得到的前肾小管和前肾导管中呈现出绿色荧光蛋白特异性表达的斑马鱼品系，wtlb:GFP品系斑马鱼是一种经由人工培育得到的前肾小球、前肾小管中有部分绿色荧光蛋白表达的斑马鱼品系。本技术方案是利用Na，K-ATPase alphalA4启动子和wtlb启动子组织特异性表达互补，通过分离元件杂交稳定整合，将其不同的绿色荧光蛋白表达性状加以集中整合，从而获得具有新性状特征的斑马鱼品系。所获得的斑马鱼品系在原肾小球、原肾小管与原肾导管中同时具备绿色荧光蛋白表达性状。根据常规的杂交育种操作方法，本专利技术方法依照杂交亲本选育、配组繁殖、杂交性状筛选、杂交子代培育、杂交性状固定与保留几个步骤加以实施。在亲本选育中，挑选已达性成熟且具有良好绿色荧光蛋白表达性状的亲本斑马鱼，加以人工饲养作为亲本雌雄鱼。在配组繁殖中，采用常规配组繁殖方法获得斑马鱼受精卵。在杂交性状筛选中，于荧光显微镜下观察受精卵绿色荧光蛋白基因的表达情况，挑选出前肾小球、小管和导管中均有荧光显示的斑马鱼胚胎，采取进一步的杂交子代培育。在杂交子代培育中，采用人工饲养方法获得杂交子一代F1。在杂交性状固定与保留中，通过杂交子代自交获得稳定遗传的全肾表达绿色荧光蛋白斑马鱼，再将其与普通斑马鱼测交，筛出100%全肾表达绿色荧光蛋白胚胎对应的亲本斑马鱼作为双整合纯系留种保存。上述技术方案可以采取优化的人工繁殖手段，对杂交亲本选育、配组繁殖、杂交子代培育等步骤加以优化，以获得绿色荧光蛋白均匀高效地在全肾中特异性表达的斑马鱼品系。具体包括:杂交亲本选育:将斑马鱼在循环水养殖系统中饲养，光周期为白昼14h、黑暗10h，水温26V~29°C ;每日投喂活体丰年虫或虾片3次，投食5min后清理与鱼粪、杂物及过量食物。饲养一定时间后作为亲本雌雄鱼。配组繁殖:获得斑马鱼受精卵方法是:数量2:1的亲本雌雄鱼放入交配盒中隔离培养，交配盒置于26 °C~29 °C恒温环境中进行黑暗过夜培养，光周期为白昼14h、黑暗IOh ;培养结束，混合雌雄亲鱼，将底部有栅栏的内层交配盒倾斜放置在外层交配盒上并置于26°C~29°C恒温水浴中，待亲鱼产卵；亲鱼产卵25min~35min后，取出亲鱼，挑选收集交配盒底部的受精卵。 杂交性状筛选:受精卵在26°C~29°C恒温曝气水中培育24h~28h后检测绿色荧光蛋白斑基因的表达效果，挑选前肾小球、小管和导管中均有荧光的斑马鱼胚胎进行杂交子代培育。杂交子代培育:受精后第Id~4d:所述斑马鱼胚胎在26°C~29°C环境恒温培育，获得幼鱼；受精后第5d~9d:幼鱼喂食卵黄水，每日喂食2次；受精后第IOd~16d:幼鱼混合喂食丰年虫与滤网研磨的卵黄水，具体方法是先向幼鱼饲养容器中投入少量丰年虫，25min~35min后再加入滤网研磨的卵黄水，每日喂食至少2次；受精后第17d以后:幼鱼喂食丰年虫，每日喂食2次，每日更换一半养鱼水。培养至受精后3个月获得杂交子一代Fl。杂交性状固定与保留:杂交子一代Fl经自交传代培养获得稳定遗传的全肾表达绿色荧光蛋白斑马鱼，自交传代培养时采用与杂交子代培育相同的培育饲养方法获得自代子代；自交子三代斑马鱼与普通斑马鱼测交，筛选出100%全肾表达绿色荧光蛋白胚胎对应的亲本斑马鱼作为双整合纯系留种保存。本专利技术是一种分离元件杂交稳定整合的方法，其技术效果与传统杂种优势有所区另IJ。传统杂交优势常指两种遗传基础不同的植物或动物进行杂交后，其杂交后代所表现出的各种性状均优于杂交双亲。本专利技术方法则是将启动子组织特异性表达加以互补，通过分离元件杂交稳定整合，获得组织特异性同时表达的子代。这种方法同样可以适用于其他多种转基因斑马鱼转基因性状的集中与整合。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是:(I)方法实施过程简单易控；(2)方法能够获得绿色荧光蛋白在原肾小球、原肾小管本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种获得全肾表达绿色荧光蛋白斑马鱼的方法，其特征在于：是以Na,K?ATPase?alpha1A4:GFP品系斑马鱼与wt1b:GFP品系斑马鱼互为亲本的杂交育种方法。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：裴得胜，戴玉洁，马彦博，边万平，李勤凯，陈艳玲，
申请(专利权)人：重庆绿色智能技术研究院，
类型：发明
国别省市：