本发明专利技术公开了一种培育标记中枢神经系统少突胶质细胞的转基因斑马鱼的方法、由该方法得到的转基因鱼的应用及其专用质粒。本发明专利技术提供一种培育转基因斑马鱼的方法，包括以下步骤：(1)构建lingo-1重组表达载体，所述lingo-1重组表达载体包含适当的核酸内切酶酶切位点、斑马鱼lingo-1基因启动子序列、荧光蛋白编码框和poly?A片段；(2)用步骤(1)中的重组表达载体转化斑马鱼受精卵，得到F0代；和(3)将F0代与野生型的斑马鱼杂交，得到lingo-1特异性基因标记的转基因斑马鱼。本发明专利技术还鉴定了斑马鱼lingo-1基因启动子，其核苷酸序列为SEQ?ID?No：1。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种培育标记中枢神经系统少突胶质细胞的转基因斑马鱼的方法、由该方法得到的转基因鱼的应用及其专用质粒。本专利技术提供一种培育转基因斑马鱼的方法，包括以下步骤：(1)构建lingo-1重组表达载体，所述lingo-1重组表达载体包含适当的核酸内切酶酶切位点、斑马鱼lingo-1基因启动子序列、荧光蛋白编码框和poly?A片段；(2)用步骤(1)中的重组表达载体转化斑马鱼受精卵，得到F0代；和(3)将F0代与野生型的斑马鱼杂交，得到lingo-1特异性基因标记的转基因斑马鱼。本专利技术还鉴定了斑马鱼lingo-1基因启动子，其核苷酸序列为SEQ?ID?No：1。【专利说明】培育标记中枢神经系统少突胶质细胞的转基因斑马鱼的方法及其应用
本专利技术涉及一种培育标记中枢神经系统少突胶质细胞的转基因鱼的方法及由该方法得到的转基因鱼的应用，本专利技术还涉及一种用于培育标记中枢神经系统少突胶质细胞的转基因鱼的专用质粒。具体而言，本专利技术涉及一种培育Iing0-1转基因斑马鱼的方法及由该方法得到的Iingo-1转基因斑马鱼的应用，以及用于培育Iingo-1转基因斑马鱼的专用质粒。本专利技术还鉴定了斑马鱼Iingo-1基因启动子，其核苷酸序列为SEQ ID No:1。
技术介绍
髓鞘化(myelination)即神经胶质细胞辨识并附着到轴突合适位置而形成多层紧密包裹的髓鞘的过程(Simons，2006 ;Franklin et al.，2008)。目前对许多脊椎动物的髓鞘化过程有广泛的研究。髓鞘功能是增加神经冲动的传导速度并维持与轴突的完整性，如果发生损伤或缺陷会导致诸如多发性硬化(multiple sclerosis,MS),视神经炎等病症。由髓鞘形成不正常所导致的疾病可分为两大类:髓鞘缺失或脱髓鞘(demyelination)和髓鞘形成障碍(dysmyelination)。常见的中枢神经系统脱髓鞘疾病为多发性硬化症，是一种自身免疫性疾病(autoimmune disease)，中枢的髓鞘和少突胶质细胞受到由T细胞介导的免疫攻击(Trapp，1999)。该疾病的一个重要特征是由中枢神经系统中发生的炎症反应和胶质增生(gliosis)所导致的髓鞘丢失(Fawcett & Asher, 1999 ；Logan & Berry, 2002)。对这种髓鞘病变的起因有许多假说解释(Franklin，2002，2008)，但至今仍是个迷。目前已知有许多因子参与调控CNS的轴突和髓鞘再生，如促进神经生长的神经生长因子(Nerve Growth Factor, NGF)、脑衍生神经营养因子(Brain derived NeurotrophicFactor, BDNF)等神经营养`素(Neurotrophins, NT),以及一些抑制神经再生的因子如髓鞘相关糖蛋白(Myelin-associated glycoprotein, MAG)、少突胶质细胞髓磷脂糖蛋白(oligodendrocyte myelin glycoprotein,OMgp)、髓鞘喊性蛋白(Myelin basic protein,MBP)和近年来被发现并大量研究的神经抑制蛋白(Nogo)等(Filbin,2003 ；Grados-Munro& Fournier,2003)。针对MS的基础性研究中最有代表性使用的动物模型是实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)(Trapp, 1999 ；Franklin et al.,2008)。人们已在小鼠、大鼠有限的中枢神经系统损伤后髓鞘修复的模型(如EAE)上了解许多髓鞘丢失、少突胶质细胞分化和成熟调控及再髓鞘的细胞分子机制(Bruce et al.，2009)。尽管如此，少突胶质细胞及髓鞘相关抑制因子在一个中枢神经系统损伤后本身就能很好再生的模式动物斑马鱼上的研究则起步较晚。成年斑马鱼中枢神经系统具有高度分化和完整的髓鞘，基因和蛋白组学数据显示其存在髓鞘相关抑制因子和类似于哺乳类少突胶质细胞调控因子，它是一个非常适宜开展中枢神经系统损伤后髓鞘修复过程分子机理研究的模式动物。特别地，成年斑马鱼视神经损伤后再生过程中再髓鞘机理未有报道，且髓鞘相关抑制因子除Nogo新近工作外(Abdesselem et al., 2009),其它少有研究。近期，Mi等人发现并鉴定了一种神经系统特异性跨膜蛋白LING0-1是少突胶质细胞分化成熟的负调控因子(Mi et al.，2004 ；2005)，我们及合作者在EAE动物模型上研究结果提示LING0-1的拮抗剂或针对其信号通路上的分子调控物是富有前景的CNS脱髓鞘疾病治疗的候选药物(Mi and Hu et al.，2007)。然而，Mi等前人的LING0-1研究都是在小鼠或大鼠上进行的，建立的是Iingo-1基因敲除(knockout)的小鼠模型，着重研究该基因的表达和功能。进一步地，当时的研究工作针对的是拮抗该Iingo-1受体蛋白质的药物开发。这些与本专利技术人在本申请中构建的特异性标记少突胶质细胞可视化的斑马鱼模型是有本质上的差别的。本专利技术是借助转基因操作构建在斑马鱼上特异性标记少突胶质细胞，使之成为一种特定的工具，有可能应用于筛选对少突胶质细胞影响的小分子或药物。如同以下罗列的几种已经申请专利或已被授权的转基因斑马鱼品系。目前几种少突胶质细胞特异性基因标记的转基因鱼品系如:Tg(0lig2:egfp)(Shin J.& Park HC, Appel et al.2003) ； Tg (pip: egfp) (Yoshida M & Macklin 2005)；Tg(nkx2.2a:megfp)(Kirby B.B.& Takada N，Appel et al.2006) ；Tg(mbp:egfp)(Park &Kim et al.2009) ；Tg (claudin k: gfp) (Munzel et al.2011);上述转基因鱼品系多为标记少突胶质细胞前体细胞(OPC)、pMN以及分化中或未成熟的少突胶质细胞。而本专利技术中的Iingo-1基因调控序列具备启动子性质，整合荧光蛋白编码框(如EGFP)后，可特异性的标记后期成熟的和包裹形成髓鞘的少突胶质细胞，为在位活体动态观察少突胶质细胞行为和髓鞘再生过程提供了有力的工具。转基因技术(Transgene technology)是将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体的性状的可遗传的修饰。斑马鱼是一种理想的用于转基因研究的新型模式动物，近年来发展起来的转座酶Tol2或核酸内切酶1-SceI介导的转基因方法可促使转移基因与宿主基因组更早的融合，极大的提高了斑马鱼转基因瞬时表达和稳定性表达的效率。转座酶Tol2可介导多位点的单拷贝基因与宿主基因组的整合，而核酸内切酶1-SceI则可介导低拷贝的单一位点整合。与内源基因的表达类似，外源基因在受体动物中表达需要的转基因构件包括启动子及相关调节序列、目的基因和终止信号3个基本结构。外源基因的表达会受到构建于表本文档来自技高网...
【技术保护点】
斑马鱼lingo?1基因启动子，其核苷酸序列为SEQ?ID?No：1。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：殷梧，胡兵，
申请(专利权)人：中国科学技术大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。