斑马鱼B淋巴细胞和增殖诱导配体（zAPRIL)cDNA及其克隆方法和重组应用，涉及生物基因工程领域。斑马鱼B淋巴细胞增殖诱导配体基因的克隆方法如下：TR提取斑马鱼脾脏总RNA并进行逆转录；通过Clustalw软件分析虹鳟鱼,大西洋鲑鱼,斑点绿河豚以及虹鳟鱼，大西洋鲑鱼，斑点叉尾鮰APRILcDNA保守区设计兼并引物进行PCR扩增，获得600bp全长cDNA。所述斑马鱼B淋巴细胞增殖诱导配体cDNA可通过现有基因工程方法，生产重组斑马鱼APRIL。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物基因工程领域，具体涉及B淋巴细胞增殖诱导配体cDNA及其克 隆、表达技术。
技术介绍
由于APRIL在外周血淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞上有较高水平的表达，与BAFF 一样能与TACI和BCMA结合，并且在小鼠体内注射大量重组APRIL可导致B细胞在脾中积 聚而引起脾的重量的增加，这就使人们认为APRIL和BAFF具有相似的功能。APRIL是一有效的T细胞体外刺激因子。APRIL除了对T细胞有增殖作用，而且还 可明显延长T细胞的存活时间。APRIL可能通过上调Bcl-2而影响了 T细胞的存活。各种研究表明，许多恶性B系肿瘤异常表达APRIL，并且这些肿瘤细胞表面表 达一种或多种APRIL受体。人们也研究了 “诱饵受体” BCMA-Fc、TACI-Fc及BAFF的单克隆 抗体对这些B系肿瘤抑制的影响，发现这些抗体及抗体类似物均能恢复这些肿瘤细胞的凋 亡作用。BAFF/APRIL配体-受体系统极有可能成为对抗多种恶性肿瘤的分子靶点库。根据GenBank、EMBL和DDBJ国际三大主要核酸序列数据库搜索结果得知，目前已 知BAFF基因序列的鱼类包括虹鳟鱼，大西洋鲑鱼，斑点绿河豚；APRIL基因序列包括虹 鳟鱼，大西洋鲑鱼，斑点叉尾鮰，并分别已在GenBank数据库中申请了序列号，序列号分别 是 ABC84582、NP_001135232, SINFRUP00000153079、EF451543、DY736744、CB940845。斑马 鱼B淋巴细胞增殖诱导配体(zAPRIL) cDNA还未被克隆出来，关于斑马鱼BAFF基因的研究 在整个国内外还处于完全空白状态。斑马鱼(Zfeflio rerio)，又名蓝条鱼、花条鱼、斑马担尼鱼，属于辐鳍亚纲 (Actinopterygii)鲤科iPyprinidae)短担尼鱼属(JMnio)的一种硬骨鱼。原产自印度东 部、巴基斯坦、缅甸、孟加拉国等南亚地区，是一种常见的热带鱼。斑马鱼是国际标准化组织 认可的5种鱼类实验动物之一，已经成为发育生物学、遗传学、毒理学等研究常用的模式生 物。60年代末70年代初，Mreisinger首先对这种生物进行了单倍体培育，建立了第 一个用紫外线突变的突变体。随着纯合子培养技术的成熟和广泛高效的突变剂ENU的出 现，位于TUbingen和Boston等地的几个实验室自1993年开始对斑马鱼进行ENU大规模系 统突变筛选和建库工作。1994年，在冷泉港召开的斑马鱼研究专题会议，标志着斑马鱼已成 为继小鼠，果蝇，线虫后又一生物学研究的重要模式生物。虽然斑马鱼最初主要被用来进行遗传学及发育生物学研究，但近几年，随着对斑 马鱼了解的日趋深入，其在免疫学中的应用也越来越为人们所重视。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供一种从斑马鱼提取的B淋巴细胞增殖诱导配体 cDNA，并提供斑马鱼B淋巴细胞增殖诱导配体cDNA的克隆方法及重组技术。本专利技术从斑马鱼中克隆到B淋巴细胞增殖诱导配体cDNA，它具有SEQ ID NO. 1所 示的序列。斑马鱼B淋巴细胞增殖诱导配体，它具有SEQ ID NO. 2所示的序列。本专利技术的斑马鱼B淋巴细胞增殖诱导配体cDNA的克隆方法如下(1)提取斑马鱼脾脏总RNA，(2)根据增殖诱导配体的保守序列设计兼并引物正义寡核苷酸引物 zAPRILl :5，- ATGGCTGAAATAACCCAGCGGTT-3， 反义寡核苷酸引物 ZAPRIL2 :5，- TCATATGCTGAAGAGCCCCATGAAG-3， (3 )通过RT-PCR方法，利用上述弓I物zAPRILl和zAPRIL2为引物，扩出编码区全长cDNA 序列(600bp)的片段，克隆入PMD-19T载体，挑取阳性克隆进行序列碱基测定。上述斑马鱼B淋巴细胞增殖诱导配体cDNA的克隆方法具体操作如下(1)利用Trizol试剂一步法提取斑马鱼脾脏组织总RNA(2)通过Clustalw软件分析虹鳟鱼，大西洋鲑鱼，斑点叉尾鮰APRIL cDNA保守区，设 计兼并引物 zAPRILl :5’ - ATGGCTGAAATAACCCAGCGGTT-3’ ；ZAPRIL2 :5’ - TCATATGCTGAAGAGCCCCATGAAG-3’ ；应用RT-PCR方法，以上述zAPRILl及ZAPRIL2为特异性引物，扩增出一段cDNA序列，全 长为600bp，克隆入pMD19-T载体，并对其碱基序列进行测定。RT-PCR的反应条件为以总 RNA为模板，在50μ 1反应体系中，加入5XRT-PCR反应缓冲液10μ l、25mM MgS042 μ 1、IOmM dNTP混合物1μ 1、20μΜ的上下游引物各2. 5 μ 1、AMV逆转录酶(Takara公司)1μ 1、Tfl DNA聚合酶1μ 1及RNA模板2 μ 1，补水至50 μ 1。RT-PCR循环参数为48°C逆转录45min， 94 V变性2 min，再进行30个PCR循环(94 V变性30s，56 V退火30s，72 °C延伸Imin )，最后 于72°C延伸7 min。RT-PCR产物用1 %的琼脂糖凝胶电泳分离后，用胶回收试剂盒回收约 600bp的DNA条带，克隆入pMD19-T载体，挑取10个阳性克隆进行碱基序列测定。(3)用MEGA 3. 1软件对GenBank上已知的各种动物(对应的GenBank号分别为 dog EU909456、horse XM001918372、pig EF591082、cattle XM581161、mouse NM023517、 rabbit EF494239、human NM003808、salmon BT050319、rainbow trout EF451543, channel catfish CB940845)的APRIL蛋白的氨基酸序列所构建的Neighbor-joining分子进化树， 显示zAPRIL与斑点叉尾鮰的亲缘关系最近，与哺乳动物的亲缘关系较远。我们构建了原核表达载体pSUMO-zsAPRIL，在大肠杆菌中就成功表达可溶性的 SUMO-zsAPRIL融合蛋白。经体外试验证实SUMO蛋白并没有对融合蛋白的活性产生影响。 且在目的蛋白和SUMO蛋白之间有一个SUMO蛋白酶切位点，可以利用SUMO蛋白酶I切割 得到不带SUMO的目的蛋白。附图说明图1是zAPRIL (GenBank NO. FJ598137)的cDNA序列及对应的蛋白序列。图2是SDS-PAGE分析SUMO-zsAPRIL在大肠杆菌中的表达1重组蛋白非诱导；2重组蛋白诱导20 h ；3纯化后蛋白SUMO-zsAPRIL ;4酶切后蛋白zsAPRIL ； 5 western blotting 图。图3是流式细胞术检测zsAPRIL对小鼠淋巴细胞的促存活作用。(a)和(c)图为 PBS检测结果，(b)和(d)图为用12yg/ml SUMO-zsAPRIL处理48h后的检测结果，细胞用 PI染色。具体实施例方式在本专利技术中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常 理解的含义。下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细地描述本发 明。应理解，这些实施例只是为本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．斑马鱼Ｂ淋巴细胞增殖诱导配体ｃＤＮＡ，其特征在于，具有ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１所示的序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张双全，闵翠，梁臻宁，
申请(专利权)人：南京师范大学，
类型：发明
国别省市：84
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