一种高脂血症转基因小型猪及其制备方法技术

本发明专利技术提供一种用于制备人类高脂血症疾病动物模型的转基因小型猪及其制备方法，采用基因工程的方法构建表达人载脂蛋白CIII(Apolipoprotein?CIII)表达载体pcDNA-CIII；通过细胞转染及细胞筛选技术筛选出可以表达人载脂蛋白CIII的小型猪成纤维细胞；利用体细胞核移植技术进行小型猪克隆。该克隆小型猪可用于研究人类高脂血症相关疾病的发病机制及相关症疾药物干预与治疗的筛选与临床前预试。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术提供一种高脂血症转基因小型猪，同时还公开了其制备方法，用于研究人 类高脂血症相关疾病的发病机制及相关症疾药物干预与治疗的筛选与临床前预试，为建立 人类疾病高脂血症提供了动物模型，属于生物医学

技术介绍
猪的主要生化指标、代谢特点都与人更相似，其脂蛋白结构与组成、脂质代谢机制 也近似人类，而且随着年龄增长，猪也可自发动脉粥样硬化。因此，基因修饰猪的研究获得 了众多科学家及投资家的青睐，成功实例也证明了其在生命科学研究中具有独特的优越性 和实用价值。小型猪比家猪体形小，更易于在动物室喂养，是研究高脂血症和动脉粥样硬化 的良好模型动物。药效评价的核心是疾病理想的动物模型的建立。传统的高脂血症动物模 型是通过喂饲高脂食物或通过化学诱导的方法制备，但是周期长、血脂水平稳定性差，限制 了其在药物评价中的作用。载脂蛋白Cni(Ap0Cin)参与富含tg脂蛋白的生成。研究发 现Ap0CIII能抑制脂蛋白脂酶(LPL)，而后者是清除血浆脂蛋白中甘油三酯的限速酶。血 浆Ap0CIII浓度与甘油三酯水平呈正相关。在转基因鼠研究中，大量表达人Ap0CIII基因 可以造成高甘油三酯血症。但未见表达人Ap0CIII基因的转基因猪的报道。
技术实现思路
本专利技术提供一种高脂血症转基因小型猪，此小型猪对探讨高脂血症相关疾病病 因、发病机理和基因治疗方法，研究基因表达调控以及进行药物干预和新药的开发试验等， 都将具有极为重要的意义。本专利技术公开了上述高脂血症转基因猪的制备方法。本专利技术高脂血症转基因小型猪，其特征如下一种高脂血症转基因小型猪，其特征在于该转基因猪含人类跨ApocIII的长 9970个碱基的一段DNA，含有5'和3'的侧翼片段，以及组织特异性表达调控区。该人类 ApocIII基因在猪体内进行了组织特异性表达，ApocIII的过表达抑制了猪体内脂蛋白脂 酶的作用，造成猪的血脂升高。本专利技术高脂血症转基因小型猪的制备方法，包括以下步骤采用基因工程的方法构建表达人载脂蛋白CIII (Apolipoprotein CIII)表达载体 pcDNA-CIII ；通过细胞转染及细胞筛选技术筛选出可以表达人载脂蛋白CIII的小型猪成纤维 细胞；并进行细胞水平的鉴定。利用体细胞核移植技术进行小型猪克隆。具体制备工艺如下1.载体的构建其基本过程为人类的跨ApocIII的长9970个碱基的一段DNA(含有5'和3'的3侧翼片段，以及组织特异性表达调控区)，位于)(bal限制性内切酶酶切位点之间，正向连接 到真核表达载体pcDNA3. 1 (+)上，命名为pcDNA-ApocIII。构建示意图见图1。经过酶切鉴定与测序后，采用北京天根公司的大提试剂盒，对载体进行大提质粒， 用于细胞转染。2. ApoCI11转基因小型猪成纤维细胞的构建本专利技术将构建的表达人载脂蛋白CIII的pcDNA-ApocIII载体线性化后(NotI酶 切)，利用FU GENE HD转染小型猪胚胎成纤维细胞，用G418筛选5 7天后，获得抗性细 胞。采用一系列的方法对所获的细胞在基因水平(PCR)、转录水平(RT-PCR)和翻译水平 (WESTERN BLOT)进行鉴定，获得了表达人载脂蛋白CIII的转基因小型猪的成纤维细胞，为 获得ApocIII转基因小型猪奠定了基础。3.利用体细胞核移植技术制备ApocIII转基因小型猪本专利技术采用体细胞核移植技术，以红色杜洛克母猪做代孕母猪，制备ApocIII转 基因小型猪，产生的ApocIII转基因小型猪的品系为白色中国小型猪。(图2)4.对ApocIII转基因小型猪的鉴定本专利技术采用1、PCR 和 Southern Blot，2、RT-PCR、Western Blot，3、血菜脂质分析 (血浆甘油三酯含量，FPLC快速蛋白液相色谱分析)，4、脂蛋白脂酶活性分析以及5、转基因 小型猪脂负荷实验验证ApocIII转基因小型猪的整合及表型。4. 1检测ApocIII转基因小型猪基因整合情况剪取转基因克隆猪的脐带，提取基因组，利用PCR扩增ApocIII (引物5’_CCA GAA ATCACC CAA AGA CA-3，和 5，-GGA AAT GAG GGA TAA AAC GG-3，)其中的一段，产物长度 888bp ；利用Southern Blot进行DNA杂交(以上述PCR产物888bp探针，杂交由EcoRI酶 切得到的一段3. Ikb的ApocIII片段)，证明其目的基因的整合。PCR(图3A)和Southern Blot (图3B)结果表明，目的基因整合到克隆猪的基因组 中。表明本实验所构建的克隆猪为转基因克隆猪。4. 2检测转基因小型猪ApocIII的基因表达情况准备肝、小肠、心、肾、肺、脾、胃、皮肤等冰冻组织以提取RNA，反转录按试剂盒说明 操作，所获得的 cDNA 即用于 PCR 反应(引物5，-TAG GA ATTC GAA CAG AGG TGC CATGC-3 和 5，-TAG CTC GAG TAT TGA GGT CTC AGG CA-3，·)。获得健康猪的血浆用于 WesternBlot 分析。RT-PCR(图4A)和^festern Blot (图4B)结果表明，ApocIII基因在转基因猪体内 进行了表达，而且主要在肝和小肠进行了表达。4. 3血浆脂质分析抽取5ml转基因猪的血浆。甘油三酯测定采用酶法，分采食与禁食两种情况的检 测，由商业试剂盒(中生北控)完成。FPLC(快速蛋白液相色谱分析)按操作程序进行。血浆甘油三酯含量检测结果(图5)表明，转基因组是对照组的2. 3倍；FPLC分析 显示，富含ApocIII的VLDL，转基因组是对照组2. 4倍。4. 4脂蛋白脂酶活性分析转基因猪按lOul/kg静脉注射肝素钠，制备肝素后血浆标本，以放射性同位素标 记法检测脂蛋白脂肪酶活性。测定结果(图6)显示，转基因猪LPL活性降低了 2.4倍，差异显著。4. 5转基因小型猪口服脂负荷(OFTT)实验两组小型猪，转基因组和正常对照组各4只，禁食14小时，不禁水。小猪绑定好后， 按体重大小给服橄榄油，标准为10ml/kg。10分钟内进食完成。分别采集餐前(O点)及餐 后30，60，90，120，150，180和210分钟血液，共采集8次。血液由前腔静脉采集，肝素钠抗 凝，3000rpm离心lOmin，取上清血浆备用。OFTT实验结果(图7)显示转基因组相对于对照差异极为显著(ρ < 0. 005)本专利技术的积极效果在于由于小鼠的很多生理功能及发病机制与人差异很大，许 多在小鼠上的实验结果不能直接应用于人体。而猪的主要生化指标、代谢特点都与人更相 似，其脂蛋白结构与组成、脂质代谢机制也近似人类，而且随着年龄增长，猪也可自发动脉 粥样硬化。猪用作高脂血症模型研究的优点在于其食性更接近于人，动脉结构与人类相 似，主动脉弓与人几乎一样，体型(尤其小型猪)大小更适合外科手术和临床评价。未见有 AP0CIII转基因猪报道。本专利技术获得的AP0CIII转基因猪，甘油三酯高于正常非转基因猪 约2倍，LPL活性降低了 2. 4倍，ApoCI11的过表达抑制了 LPL的活性。显示本专利技术获得的 AP0CIII转基因猪可用本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高脂血症转基因小型猪，其特征在于：该转基因猪含人类跨ＡｐｏｃⅢ的长９９７０个碱基的一段ＤＮＡ，含有５′和３′的侧翼片段，以及组织特异性表达调控区。该人类ＡｐｏｃⅢ基因在猪体内进行了组织特异性表达，ＡｐｏｃⅢ的过表达抑制了猪体内脂蛋白脂酶的作用，造成猪的血脂升高。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：邓旭明，魏静元，欧阳红生，刘国庆，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：82