本发明专利技术公开了一种用于生产转基因猪的ｐｉｇｇｙＢａｃ转座载体的构建方法，包括以下步骤：将加入了ＦＲＴ位点的ＺｓＧＦＰ基因连接到转座子ＰＸＬ－ＢＡＣ Ⅱ上形成重组载体ＰＸＬ－ＢＡＣ Ⅱ－ＺｓＧＦＰ；再将加入了ＦＲＴ位点的Ｎｅｏｍｙｃｉｎ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ基因连接到ＰＸＬ－ＢＡＣ Ⅱ－ＺｓＧＦＰ，得重组通用载体ＰＸＬ－ＢＡＣ Ⅱ－ＺｓＧＦＰ－Ｎｅｏ。该载体具有ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１所示的核苷酸序列。本发明专利技术的转座载体能满足细胞筛选、鉴定及高效转基因的要求。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及构建一个用于生产转基因猪的新型piggyBac转座载体及其构建方法。
技术介绍
piggyBac (以前叫作IFP2)转座子，是一个来源于鳞翅目昆虫的DNA型转座子，在结构 上与II型短的插入重复因子相关，在分类上属于第二类型，这一类型的因子包括hobo、 hermers、 mariner、 P、 Tcl禾口AC因子。piggyBac转座子最初是在杆状病毒(Baculovirus)侵 染7Hc/w/ /wwb/昆虫TN-368细胞株系时，从Ga〃en'we〃owe〃a (GmMNPV) ^Uwtograp/^ ca/z/o^Zca (AcMNPV)核多角体病毒内首次分离得到的。piggyBac转座子是一个自主因子，长2476bp，含有一个RNA聚合酶II启动子区和一个聚 腺苷酸信号，该信号的侧面是一个可读编码框(ORF)，编码l个单一的长约2.1kb的转录产 物，B卩l个68kD的转座酶，该转座酶是转座子高频率的切出和转座所需的。piggyBac转座子 的末端是长13bp的反向重复序列(ITR)，其内侧各有一段间隔区(spacer),但并不对称(左 端长3bp，右端长31bp)，再靠内侧是各长19bp的对称的亚末端反向重复(STR)(图l)。 piggyBac转座子反向重复序列的5'末端以2-3个C碱基结束，3'末端的G碱基在切出位点的 选择过程中起作用。piggyBac转座子总是在TTAA目标位点处插入，因而被归纳为TTAA—— 一特殊的可转移因子家族。目前，piggyBac转座系统已成为在昆虫中使用最广的转座子，它已被证明能够在5个目 (鳞翅目、双翅目、膜翅目、鞘翅目和直翅目)的20多种昆虫中转座。piggyBac转座主要用 于昆虫的转基因研究，其携带的基因大多为可见的报告基因，如ZsGFP， DsRedl， EYFP等 荧光标记。它们收位置影响比较小，可以很方便地测试转座效率。piggyBac在昆虫中具有广泛的转座活性，鼓舞着研究者将它的应用拓展到其它的非脊椎 动物中。piggyBac在非脊椎动物中广泛而高效的转座能力提示我们piggyBac的转座可能较少 地依赖于宿主特异性的因子。随后的研究表明piggyBac转座系统不仅能在昆虫中使用，而且 能在脊椎动物中使用，甚至在高等动物中也具有活性，如人，小鼠等(见Cell， 122, 473-483， 2005)。但迄今为止还没有能用于转基因猪载体的构建。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种能应用于生产转基因猪的piggyBac转座子。为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种用于生产转基因猪的piggyBac转座载体的构建 方法，包括以下步骤将加入了FRT位点的ZsGFP基因连接到转座子PXL-BACII上形成重组 载体PXL-BAC II -ZsGFP;再将加入了FRT位点的Neomycin Resistant基因连接到PXL-BAC II -ZsGFP，得重组通用载体PXL-BAC II -ZsGFP-Neo。本专利技术还同时提供了按照上述方法构建的重组通用载体PXL-BACII-ZsGFP-Neo，该载 体具有SEQ ID No: 1所示的核苷酸序列。本专利技术构建了一个用于生产转基因猪的新型piggyBac转座载体；该载体包括一个ZsGFP的报告基因， 一个Neomycin的抗性筛选基因，以及可以将这2个基因剔除的FRT位点；并将其连接到piggyBac，便于检测和筛选。在本专利技术中，选用名称为PXL-BACII的一种piggyBac转座子；通过PCR从RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen载体中得到ZsGFP基因，连接到PXL-BACII上形成重组载体PXL-BACII-ZsGFP;再用PCR从pSilencer4.1-CMVneo载体上得到Neomycin Resistant基因，连接到PXL-BAC II -ZsGFP上，形成重组载体PXL-BAC II-ZsGFP-Neo。为了后期能将这两个筛选基因给剔除掉，又在ZsGFP基因和Neomycin Resistant基因的两端加入了 FRT位点，形成最终的转座载体PXL-BACII-FRT-ZsGFP-Neo。由于piggyBac转座子发生转座需要在转座酶的作用下，因此需要一种公知的能编码转座酶的Helper质粒。上述方法构建的重组通用载体PXL-BAC II -ZsGFP-Neo转座载体能在Helper质粒的帮助下高效转座，将目的DNA转座到宿主猪基因组上，形成转基因动物。综上所述，本专利技术的优点如下，构建一个新型的piggyBac转座子，能应用与生产转基因猪。该系统具有高效性和稳定性，并且具有一个ZsGFP的报告基因， 一个Neomycin的抗性筛选基因，便于检测和筛选。由于在ZsGFP报告基因和Neomycin抗性基因的两端加入了FRT位点，因此最终可以将这两个基因给剔除掉。本专利技术的转座载体能满足细胞筛选、鉴定及高效转基因的要求。附图说明下面结合附图对本专利技术的具体实施方式作进一步详细说明。图1是piggyBac转座子的结构示意图2是构建PXL-BAC II -ZsGFP载体示意4图3是构建PXL-BACII-ZsGFP-Neo载体示意图4是piggyBac转座系统应用在猪PK15细胞中，观察到的绿色荧光蛋白表达示意图。图5是piggyBac转座载体转座后PK15细胞中目的基因的PCR扩增图； 图5中M，标准分子量；1，阴性细胞ZsGFP基因；2，阳性细胞ZsGFP基因； 3，阴性细胞Neo基因；4，阳性细胞Neo基因。具体实施例方式实施例l、 ZsGFP报告基因的获取及连接RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen载体为模板，并设计ZsGFP报告基因的引物，该 引物具体如下ZsGFP-F: GGATATCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGG ZsGFP-R: GGGCACCCTGGAAACAT ; 在正向引物的前端加入一个FRT位点，得 ZsGFP-FRT-F:(gatatc为￡coRv酶切位点，下划线为FRT位点序列)。 ZsGFP-R:同上。PCR合成的条件为94。C预变性5分钟，再以94°C/45sec， 55°C/45sec， 72°C/2min，共 35个循环，最后72'C延长10分钟，将PCR产物回收后连接到PXL-BACII上。具体内容如 下(如图2所示)将上述PCR产物和PXL-BACII质粒分别用五coRv和J/ 0 I双酶切；凝 胶回收后用T4连接酶相连接，形成PXL-BACII-ZsGFP。实施例2、 Neomycin筛选基因的获取及连接以pSilencer 4.1-CMVneo载体为模板，并设计Neomycin筛选基因的引物，该引物具体 如下Neomycin-F: CTCGAGAAGCCTATAGAGTACGAGCCANeomycin-R: AGATCTCAGACATGATAAGATACATTGATGA ;在反向引物的前端加入一个FRT位点，得 Neomycin-R :为Sg/II酶切位点，下划线为FRT位点序列)； Neomycin-F 同上。PCR合成的条件为94。C本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于生产转基因猪的ｐｉｇｇｙＢａｃ转座载体的构建方法，其特征是包括以下步骤：将加入了ＦＲＴ位点的ＺｓＧＦＰ基因连接到转座子ＰＸＬ－ＢＡＣ Ⅱ上形成重组载体ＰＸＬ－ＢＡＣ Ⅱ－ＺｓＧＦＰ；再将加入了ＦＲＴ位点的Ｎｅｏｍｙｃｉｎ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ基因连接到ＰＸＬ－ＢＡＣ Ⅱ－ＺｓＧＦＰ，得重组通用载体ＰＸＬ－ＢＡＣ Ⅱ－ＺｓＧＦＰ－Ｎｅｏ。
【技术特征摘要】
1、一种用于生产转基因猪的piggyBac转座载体的构建方法，其特征是包括以下步骤将加入了FRT位点的ZsGFP基因连接到转座子PXL-BAC II上形成重组载体PXL-BAC II-ZsGFP；再将加入了FRT位点的Neomycin Resista...
【专利技术属性】
技术研发人员：缪云根，周继勇，杨华军，胡嘉彪，周芳，曹晶晶，颜焰，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]
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