直接复合ＰＥＩ的磁基因载体的制备方法技术

一种生物技术领域的直接复合ＰＥＩ的磁基因载体的制备方法，该方法包括如下步骤：步骤一，取ＦｅＣｌ３和ＦｅＣｌ２，采用共沉淀法制备磁性粒子；步骤二，将磁性粒子与聚乙烯亚胺复合，即得磁基因载体。本发明专利技术制备的磁基因载体具有较强的ＤＮＡ结合力，可以携带外源基因进行体外基因转染；在外加磁场作用下，转染效率明显提高５～１０倍，转染时间缩短到１小时。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种生物
的载体的制备方法，具体是一种直接复合PEI的磁 基因载体的制备方法。
技术介绍
作为遗传性和感染性疾病的新型治疗方式，基因治疗近年来引起越来越广泛的 关注。然而，在开发安全有效的基因载体的过程中所面临的种种挑战和困难却限制了这 种治疗方式在临床上的应用。三分之二的临床试验采用病毒载体，但其存在诸多缺陷 (C. E. Thomas, A. Ehrhardt， M. A. Kay， Progress and problems with the use of viral vectors for genetherapy。 Nat. Rev. Genet. 4， 2003， 346 358)，如免疫原性高，潜在至文瘤 性，体内不能反复应用，价格昂贵等等。因此，人们开始将目光集中在安全，低毒，操作方便 的非病毒基因载体的研发。大多数非病毒载体是带有静电的复合物，包括阳离子脂质体， 阳离子高聚物，以及脂质_高聚物-DNA的三重复合物等。它们在体外实验中显示出了较 高的基因转染效率，然而在体内靶组织的聚集速率和表达水平却很低。为了克服非病毒基 因载体在转染过程中组织特异性差，细胞毒性相对较高以及易被水解酶降解等的缺点，一 些物理学的原理和方法被辅助用来进行基因转染，如电击，超声，流体力学，磁介导等。磁 介导是将药物磁靶向输送的理念引入到基因载体当中，并在具体研究中显示出巨大的潜 力。其主要是利用外加磁场将与顺磁性粒子结合的基因载体吸引到细胞表面，从而达到快 速有效转染的目的，并在一定程度上减少了载体剂量，降低了细胞毒性，而与顺磁性粒子结 合的基因载体的构建也成为该方法的重中之重。Wenzhong Li等将与DNA复合的PEI通过 Sulfo-NHS-LC-Biotin连接到包被有链霉亲和素的磁珠上来构建基因载体并实现了基因 的心脏革巴向(Wenzhong Li， CatharinaNesselmarm， Zhaohui Zhou. Gene delivery to the heart by magnetic nanobeads. Journal of Magnetism and Magnetic Materials. 2007， 311,336 341) ;Povey AC等用半透性的尼龙膜将PEI与磁铁矿包裹起来构建磁微囊 (Povey AC， Bartsch H， Nixon JR， 0' Neill IK. Trapping of chemical carcinogens with magnetic polyethyleneiminemicrocapsules :I. Microcapsule preparation and in vitro reactivity ofenc即sulated皿cleophiles. J Pharm Sci， 1986， 75， 831 837)，该 方法后来被德国Chemicell公司采用并研制出了商用基因转染磁珠transMAGPEI。 经对现有技术的文献检索发现，尚未见与本专利技术主题直接复合PEI的磁基因载 体的制备方法有关的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种直接复合PEI的磁基因载体的 制备方法。本专利技术制备的磁基因载体具有较强的DNA结合力，可以携带外源基因进行体外 基因转染；在外加磁场作用下，转染效率明显提高5 10倍，转染时间縮短到1小时。 本专利技术是通过以下的技术方案实现的，本专利技术涉及一种直接复合PEI的磁基因载体的制备方法，包括如下步骤 步骤一，取FeCl3和FeCl2，采用共沉淀法制备磁性粒子； 步骤二，将磁性粒子与聚乙烯亚胺复合，即得磁基因载体。 步骤一中，所述共沉淀法具体为将FeCl3和FeCl2溶于脱气水中，制备铁盐溶液， 将铁盐溶液置于冰水浴中，在氮气保护下边搅拌边进行如下操作逐滴滴加NaOH的水溶 液，当pH值为10. 5 11时停止滴定，继续冰浴；在氮气保护下将溶液油浴，离心，得磁性粒子。 按摩尔比，FeCl3与FeCl2的比值为2:1。 所述NaOH的水溶液的浓度为5M。 所述继续冰浴的时间30分钟。 所述油浴为8(TC油浴1小时。步骤二中，所述复合具体为将磁性粒子溶于去离子水中，得溶液；搅拌条件下，取溶液逐滴滴加到聚乙烯亚胺的PBS溶液中，之后对该溶液进行透析，得磁基因载体。 所述搅拌的时间为3小时。 所述聚乙烯亚胺的分子量为25000。 所述透析使用的为透析分子量为10， 0000的透析袋。 本专利技术以FeCl3和FeCl2为原材料，采用共沉淀法合成磁性纳米粒子，然后在其表 面复合PEI，得到携带有阳离子聚合物的磁性纳米载体。 与现有技术相比，本专利技术具有如下的有益效果本专利技术制备的磁基因载体具有较 强的DNA结合力，可以携带外源基因进行体外基因转染；在外加磁场作用下，转染效率明显 提高5 10倍，转染时间縮短到1小时。附图说明 图1为与PEI复合前后及与DNA结合后磁性粒子在TEM下的形貌图； 图2为MP-PEI与DNA结合后的琼脂糖凝胶电泳图； 图3为MP-PEI， PEI以及MP三者对C0S-7细胞的体外毒性对比图； 图4为不同量的MP PEI携带pGL3-contro1转染C0S-7细胞的效果比较图； 图5为外加磁场吸附对MP-PEI携带外源基因进行细胞转染的效果的影响图。具体实施例方式以下实例将结合附图对本专利技术作进一步说明。本实施例在以本专利技术技术方案为前 提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本专利技术的保护范围不限于下述的实施例。 下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的 条件。 实施例1 本实施例涉及的材料如下 氯化亚铁，氯化铁及氢氧化钠均为分析纯，购自中国医药集团上海化学试剂公 司； 非洲绿猴肾细胞系C0S-7细胞购自ATCC ; RPMI-1640培养基及血清均购自GIBIC0公司； 荧光素酶报道质粒pGL3-contro1购自美国Promega公司； PCS质粒在中国专利技术专利申请CN101095951公开说明书中公开； 荧光素酶检测试剂盒购自美国Promega公司； PEI-25K购自Sigma公司； BCA蛋白定量试剂盒购自上海业力生物技术公司； 磁基因载体的制备过程如下， 取5. 6mmol FeCl3、2. 8mmol FeCl2溶解在7ml脱气水中，得铁盐溶液，反应在2 4t:冰水浴中进行，边通入氮气边搅拌防止Fe2+氧化，并逐滴滴加5M的NaOH的水溶液于上 述铁盐溶液中，pH计在线监测pH值；当pH值为11时停止滴定，继续冰浴搅拌反应30分 钟； 之后将溶液于8(TC油浴加热1小时，使磁性粒子熟化。反应完毕后，9000rpm， 4t:离心10分钟，去掉上清，同样条件再次离心10分钟，将沉淀于离心管底的磁性粒子用 7ml去离子水重悬，然后取200ul重悬后的磁性粒子溶液，逐滴滴加到200ul 0. 075g/ml的 PEI25000的PBS溶液中(PBS的配制方法如下称取8g NaCl、0. 2g KCl、1.44g Na2HP04和 0. 24g K^P(V溶于800ml去离子水中，用HC1调节溶本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种直接复合ＰＥＩ的磁基因载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：　　步骤一，取ＦｅＣｌ↓［３］和ＦｅＣｌ↓［２］，采用共沉淀法制备磁性粒子；　　步骤二，将磁性粒子与聚乙烯亚胺复合，即得磁基因载体。

【技术特征摘要】
一种直接复合PEI的磁基因载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤步骤一，取FeCl3和FeCl2，采用共沉淀法制备磁性粒子；步骤二，将磁性粒子与聚乙烯亚胺复合，即得磁基因载体。2. 根据权利要求1所述的直接复合PEI的磁基因载体的制备方法，其特征是，步骤一 中，所述共沉淀法为将FeCl3和FeCl2溶于脱气水中，制备铁盐溶液，将铁盐溶液置于冰水 浴中，在氮气保护下边搅拌边进行如下操作逐滴滴加NaOH的水溶液，当pH值为10. 5 11 时停止滴定，继续冰浴；在氮气保护下将溶液油浴，离心，得磁性粒子。3. 根据权利要求2所述的直接复合PEI的磁基因载体的制备方法，其特征是，按摩尔 比，FeCl3与FeCl2的比值为2 : 1。4. 根据权利要求2所述的直接复合PEI的磁基因载体的制备方法，其特征是，所述 NaOH的水溶液的浓度为5M。5. 根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐宇虹，郭微，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]