转基因兔的生产方法技术

本发明专利技术公开了一种转基因兔的生产方法，该方法包括以下步骤：（１）克隆Ｆａｔ１基因和ＰＧＫ１调控元件；（２）将步骤（１）所得Ｆａｔ１基因和ＰＧＫ１调控元件用来构建Ｆａｔ１基因真核表达载体；（３）将步骤（２）所得Ｆａｔ１基因真核表达载体注射到雄兔睾丸中；（４）对步骤（３）所得雄兔的精子进行ＰＣＲ检测，选择检测结果为阳性的雄兔与雌兔交配，所产仔兔经鉴定获得Ｆ１代转Ｆａｔ１基因的转基因兔。其中，Ｆａｔ１基因为序列表ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．１的碱基序列，ＰＧＫ１调控元件为序列表ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．２的碱基序列。本发明专利技术通过导入线虫的ｎ－３去饱和酶基因（Ｆａｔ－１），获得转Ｆａｔ１基因兔新品系。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及家畜生产的基因工程技术，尤其是涉及一种。
技术介绍
不饱和脂肪酸是细胞的基本组分之一，其摄入数量和类型直接影响到消费人群的 健康，有报道称高水平摄入n-6多聚不饱和脂肪酸(n-6 PUFAs)，尤其是同时伴有低水平 摄入n-3多聚不饱和脂肪酸(n-3 PUFAs)，会明显增加患乳腺癌、大肠癌和前列腺癌的危险 性。目前，大部分西方国家人民体内n-6/n-3 PUFAs的比例超过18 1，由此引发多种细胞 和机体功能障碍甚至癌症。这主要是由于哺乳动物体内缺乏合成n-3 PUFAs前体的酶，也 缺乏能够将n-6 PUFAs转化为n-3 PUFAs的酶。因此，增加n_3 PUFAs的摄入量对于人类 健康具有极其重要的意义。家兔是一种用途广泛的经济性动物，目前国内外市场兔肉需求量不断加大。一方 面因为家兔具有繁殖速度快、生产周期短等优点；另一方面，兔肉蛋白质含量显著高于猪 肉、牛肉和羊肉，同时其脂肪含量低且多为不饱和脂肪酸。因此，大力发展养兔业不仅可以 增加农民收入，而且还能提高人们的健康和生活水平。近年研究发现线虫Caenorhabditis elegans (C. elegans)的n_3脂肪酸去饱 和酶能够以十八碳或二十碳的n-6 PUFAs为底物分别合成相应的n-3 PUFAs。此外，线 虫C. elegans的n-3去饱和酶基因(Fatl)被转入哺乳动物细胞以及小鼠能使其n_3 PUFAs (从十八碳到二十二碳)的含量显著提高。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种操作简便、成本低廉且快速的转基因兔的 生产方法，以改善家兔的肉质提高兔肉中不饱和脂肪酸含量，为人们的健康生活提供富含 n-3PUFAs的肉类食品。为解决上述技术问题本专利技术采用如下技术方案，该方法包 括以下步骤(1)克隆Fatl基因和PGK1调控元件；(2)将步骤(1)所得Fatl基因和PGK1调控元件用来构建Fatl基因真核表达载 体；(3)将步骤(2)所得Fatl基因真核表达载体注射到雄性兔睾丸中；(4)对步骤(3)所得雄性兔的精子进行PCR检测，选择检测结果为阳性的雄性兔与 雌性兔交配，所产仔兔经鉴定获得F1代转Fatl基因的转基因兔。Fatl基因为序列表SEQ. ID. No. 1的碱基序列。克隆Fatl基因中设计合成的特异引物为P1 5' CTTCCGACATTGATTATTGAC3‘禾口 P2:5' GATCCACATGATAAGATAC3‘。PGK1调控元件为序列表SEQ. ID. No. 2的碱基序列。3Fatl 基因真核表达载体为 pMD-PGKl-Fatl-CMV-EGFP。注射以DMS0或脂质体为转导试剂配制注射液。本专利技术采用Fatl基因和PGK1调控元件构建了 Fatl基因真核表达载体，通过睾丸 注射向雄性家兔的精原细胞中导入Fatl外源基因，然后由PCR检测阳性的雄兔与正常雌兔 交配，所产F1代仔兔即是整合Fatl外源基因的转基因兔。因为Fatl基因表达的n_3去饱 和酶能使哺乳动物体内十八碳或二十碳的n-6 PUFAs转化成相应的n-3 PUFAs，所以本专利技术 获得的转Fatl基因兔，其兔肉中不饱和脂肪酸的组成和含量应有明显改善。附图说明图1是转Fatl基因组成型真核表达载体构建示意图。图2是Fatl基因真核表达载体的物理图谱。具体实施例方式1.调控元件的克隆与验证应用oligo6. 0软件设计一对特异性扩增引物P1 :5，GAATTC AATGTAGGAGAGTTCCAGTGGC 3，(5'含 Kpnl 位点)禾口P2 :5，CTCGAG GATGAGACAGCGGCAGAGAC 3' (5'含 Xho I 位点)。以水牛基因 组为模板，并以PI、P2为引物，按照以下程序进行扩增94°C预变性2min ；以94°C 30sec, 64°C 3min，反应35个循环，64°C延伸8min。反应结束后，取PCR反应液5 10 y L进行琼 脂糖凝胶电泳检测获得PGK1基因调控元件DNA片段。应用胶回收试剂盒回收目的片段，将 回收的片段与PMD-18T载体以摩尔比约2-10 1混合，按说明书14 16°C水浴反应过夜， 次日取5yL lOyL连接产物转化感受态大肠杆菌。挑取转化后在LB平板上长出的单菌 落，在另一块含有Amp的LB板上划线培养12-16h ；用枪头挑取少量菌体，涂于含有10 y L 灭菌水的离心管内。充分悬浮菌体后，加入等体积的2XCracking buffer ；轻轻混勻后取 15 yL电泳，设阴性对照，鉴定出插入目的片段的克隆，纯化后送上海捷瑞生物公司进行测 序验证，获得质粒PMD18T-PGK1。测序结果表明，PGK1基因调控元件长2013bp (见序列表 SEQ. ID. No. 2)。纯化质粒pMD18T-PGKl和pEGFP-附，以Sal I和BamH I对两个质粒分别进行双酶 切，得到含有水牛PGK1启动子的片段，将其连接到酶切去除CMV启动子的pEGFP-Nl中，最 终建成含有水牛PGK1基因启动子的真核表达载体pPGKl-EGFP-Nl，长达6. 2Kb。采用PCR 和酶切分析对构建载体进行全面验证，确认得到了设计的真核表达载体。用Omega无内毒 素质粒小量提取试剂盒提取构建好的pPGKl-EGFP-Nl，并以ApaL I酶切线性化后电泳胶回 收；或以ApaL I酶切后用2. 5倍体积的无水乙醇和1/10体积的乙酸钠沉淀DNA。12000rpm 离心10分钟，收集沉淀，75%乙醇洗涤。真空抽干，溶解DNA于灭菌超纯水中。兔胎儿成纤维细胞培养与转染取预处理兔胎儿体部皮肤组织剪切成1mm3左右 的小块。用0. 25%胰蛋白酶消化后，用含15% FCS的DMEM培养液制备细胞悬液，最终以 1 X 106个/mL的密度接种于培养瓶，置37°C、5% C02饱和湿度的培养箱中进行原代培养，每 隔3 4天换一次液。当原代细胞生长至90%汇合时，按照1 3比例进行传代培养。阳 性脂质体法细胞转染外源DNA片段将传至3代的细胞生长到80-90%汇合时开始转染。将2. 0u g线性化pPGKl-EGFP-Nl质粒DNA稀释在100 u L无血清双抗的培养液DMEM中，轻轻 混勻。脂质体使用前先轻轻摇勻，取15y L脂质体稀释在lOOy L无血清双抗的培养液DMEM 中，混勻，室温放置5min。将含有质粒DNA的DMEM和含有脂质体的DMEM轻轻混勻，室温静 置20min，使形成DNA-脂质体复合体。在DNA/脂质体混合液中继续加入800 u L无血清双 抗培养液DMEM，混勻。取欲转染的细胞，吸出培养液，再用无血清双抗培养液DMEM洗细胞2 次。将DNA-脂质体混合液加入培养皿中，前后轻轻摇晃培养皿使之分布均勻，放入C02培 养箱内，37°C培养8h。吸出转染液，加入2mL不含双抗的培养液DMEM+10% FCS，继续培养， 转染后24h在荧光显微镜下观察，能够看到部分家兔胎儿成纤维细胞表达EGFP，证明水牛 PGK1启动子可以启动目的基因在家兔细胞中转录。2.转Fatl基因组成型真核表达载体的构建(见图1和图2)(1)目的基因Fatl的获得设计合成特异引物P1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种转基因兔的生产方法，其特征在于包括以下步骤：（１）克隆Ｆａｔ１基因和ＰＧＫ１调控元件；（２）将步骤（１）所得Ｆａｔ１基因和ＰＧＫ１调控元件用来构建Ｆａｔ１基因真核表达载体；（３）将步骤（２）所得Ｆａｔ１基因真核表达载体注射到雄性兔睾丸中；（４）对步骤（３）所得雄性兔的精子进行ＰＣＲ检测，选择检测结果为阳性的雄性兔与雌性兔交配，所产仔兔经鉴定获得Ｆ１代转Ｆａｔ１基因的转基因兔。

【技术特征摘要】
一种转基因兔的生产方法，其特征在于包括以下步骤(1)克隆Fat1基因和PGK1调控元件；(2)将步骤(1)所得Fat1基因和PGK1调控元件用来构建Fat1基因真核表达载体；(3)将步骤(2)所得Fat1基因真核表达载体注射到雄性兔睾丸中；(4)对步骤(3)所得雄性兔的精子进行PCR检测，选择检测结果为阳性的雄性兔与雌性兔交配，所产仔兔经鉴定获得F1代转Fat1基因的转基因兔。2.根据权利要求1所述的转基因兔的生产方法，其特征在于所述Fatl基因为序列表 SEQ. ID. No. 1的碱基序列。3.根据权利要求1所述的转基因兔的生产方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘庆友，石德顺，陆凤花，刘玉兵，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：45[]