本发明专利技术公开了多疣壁虎Hoxc10蛋白的体外表达及多克隆抗体制备方法，包括多疣壁虎Hoxc10的EST序列的获得，RACE法获得Hoxc10全长序列，采用DNASTAR软件和SWISS-PLOT在线预测多疣壁虎Hoxc10蛋白的抗原表位，选取优势表位肽段构建Hoxc10的原核表达载体，体外诱导融合蛋白表达，融合蛋白的纯化及多克隆抗体的制备等步骤。本发明专利技术以pGEX-4T1为基础所构建的体外Hoxc10表达系统在BL21中能高效地表达目的蛋白，进一步进行纯化，可方便地获得大量的GST-Hoxc10融合蛋白，经此蛋白免疫新西兰大白兔所制备的兔源抗多疣壁虎Hoxc10抗血清滴度高、特异性好。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种多疣壁虎HoxclO蛋白的体外表达及多克隆抗体制备方法。
技术介绍
同源异型框基因(homeobox gene，Hox)，编码一个高度保守的转录因子家系，这些转录因子在胚胎发育的形态发生中起关键作用，能够维持正常的体节形成，菱脑原节形成和发育，以及后脑和各个器官、组织及四肢的正常的分化和发育。HoxclO是Hox基因家族中一位重要的成员。已有研究表明，HoxclO不仅影响脊椎动物的胚胎发育，尤其是神经系统发育，同时也影响脊椎动物的断肢及尾部的再生过程。市场上多是针对小鼠、人及大鼠 HoxclO的抗体，这些抗体与羊、兔、猴等有一定的交叉反应，针对多疣壁虎的HoxclO蛋白高特异性、高滴度的抗体目前还没有。为进一步探究HoxclO在多疣壁虎断尾再生过程中的作用及其他相关生物学功能，本专利拟制备兔源抗多疣壁虎HoxclO抗体。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种能大量制备出高质量的抗多疣壁虎HoxclO蛋白抗体的多疣壁虎HoxclO蛋白的体外表达及多克隆抗体制备方法。本专利技术的技术解决方案是步骤1)、多疣壁虎HoxclO的EST序列的获得根据同源比对小鼠、人、鸡等物种HoxclO基因序列，设计一对简并引物，序列如下 上游引物 F: 5’-TGTCTCTCAACACCTACCCATC-3’ ； 下游引物 R: 5' - GTTCTCCCK(G/T)GTTCATTTTCT _3’， 基因克隆获得多疣壁虎HoxclO的EST序列。步骤2)、多疣壁虎HoxclO全长序列获得RACE法获得多疣壁虎HoxclO的5，cDNA和3，cDNA序列，与EST序列拼接后得到多疣壁虎HoxclO全长序列，共包含2156bp，其ORF区位于112_1242bp，共编码376个氨基酸。 经生物学相关分析确认为多疣壁虎HoxclO基因。GenBank登陆号GQ267528. 1步骤3)、使用DNA STAR软件和SWISS-PLOT在线预测多疣壁虎HoxclO抗原表位，通过综合分析发现HoxclO抗原表位极有可能位于氨基酸4-6，21-24，27，29-30, 36-42，45，57，7 2-73，78-81, 83-85, 99，131-132, 136，147-149，153-154，162-165，205-206，209，211，216-217， 226，233-234，240-241，271-274，295，301-302，308-310，337，370，372-373。本专利选取含有预测抗原表位较多的96-191片段为免疫肽段(对应397-684核苷酸序列)。步骤4)、构建HoxclO的原核表达载体1.设计构建HoxclO原核表达载体的引物，上游引物5’端加上B10 I酶切位点及其保护碱基和补充碱基使其不出现移码，序列为5’- CCGGAATTCCAACTCCCCTCCTGCTCT-3’ ；下游引物在其5’端加上EcoR I酶切位点及其保护碱基和补充碱基使其不出现移码，序列为5，- CCGCTCGAGCGGTTGCTCCAGATGCTC-3，； 2.取多疣壁虎脑，脊髓及部分其他组织，用Trizol试剂法提取总RNA ；3. RT-PCR扩增用 QIAGEN公司逆转录试剂盒及2 μ g总RNA进行逆转录反应，合成cDNA ；4.采用原核表达引物，以合成的cDNA为模板进行多疣壁虎HoxclO的397-684核苷酸序列(对应蛋白表位优势肽段96-191) PCR扩增；5.用限制性内切酶)(ho I、EcoR I消化HoxclO的PCR产物和PGEX-4T1原核表达载体质粒，并进行酶切产物的胶回收。6.连接用T4 DNA连接酶将 PCR酶切回收产物和PGEX-4T1原核表达载体质粒的酶切回收产物连接；7.感受态细胞的制备用无菌接种棒从_70°C保存的DH5 α菌株中蘸少许菌液划无氨苄青霉素LB琼脂板， 37°C培养过夜后挑取单个克隆接种于5ml LB培养基中，置细菌培养摇床中于37°C、250转/ 分震荡培养12小时。取0. 5ml该菌液接种于无氨苄青霉素IOOml LB液体培养基中，37°C 震荡培养2-2. 5小时，至OD6tltl为0. 4-0. 5时，放置于4°C冰箱冷却1_2小时。将培养液分入两个50ml离心管中，4°C离心，4000gX10分钟，弃去上清，用冰浴的0. IM MgCl2 25ml悬浮 30分钟。4°C离心，4000gX10分钟，弃去上清，加入冰浴的0. IM CaCl2-甘油溶液Iml悬浮。 以100 μ 1/管分装入1. 5ml离心管中，-70°C冻存备用。8.重组质粒的转化取5μ 1 DNA 连接产物加入100 μ 1感受态细胞中，轻轻旋转数次使DNA分散均勻，冰浴30分钟，42°C水浴中热休克90秒，继续冰浴2-3分钟后加入LB培养基200 μ 1，于37°C缓摇孵育60分钟， 将培养物适量涂于1. 5%琼脂LB平板(含氨苄青霉素)，待胶表面没有液体流动时，37°C温箱倒置培养12-16小时；9.重组克隆的筛选及酶切鉴定从上述培养板中挑取6个克隆接种于5ml含氨苄青霉素的LB培养基中，37°C震荡培养过夜，以碱裂解法小量提取质粒DNA，限制性内切酶消化1小时，电泳鉴定DNA目的片断是否正确构建于表达载体中；10.将双酶切鉴定为阳性克隆的质粒进行测序鉴定，其测序结果序列与基因库中397-684核苷酸序列完全一致。 1 CAACTCCCCTCCTGCTCTTTCCCGACCAATGTCAAGGAAGAAAATGCCTG 51 CTGCATGTACAACGCAGACAAAAGGGCTAAAAACGCCACCGAGGCGACCC 101 TCTACCCCAGTCAGATGCCTGAATCTTGCCTCAGTGACCATGAAGTCCCC 151 GTGCCCAGCTACTACCGCGCCAGCCAAGGTTATTCCTCCATGGAGAAGGC 201 GTCCAACTGCAACAACCCGACCGAGTTTGAGGCAACTTTCGAACCCAGGG 251 CGAGCCTCAGCCAGAGGAGTGAGCATCTGGAGCAACCG步骤5)、目的蛋白的表达BL21感受态细胞的制备(方法同上述DH5ci感受态细胞的制备)。用鉴定正确的pGEX-4Tl-HoXC10重组质粒转化BL21感受态细胞，挑取含重组质粒的菌体单斑至anl LB培养基(含氨苄青霉素50mg/L)中37°C震荡培养过夜。将Iml菌液加入到含50ml LB培养基的IOOOml培养瓶中，37°C震荡培养至OD6tltl为0. 6左右，取Iml菌液作为未诱导的对照组，余下菌液中加入异丙基- β -D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0. 2 mm0l/L，3(TC诱导6小时。同时以转化了 pGEX_4Tl载体的BL21细菌作阴性对照。将诱导、 末诱导的含PGEX-4T1载体的BL21菌液各1ml，室温IOOOOg离心1分钟，弃去上清，0. OlM PBS 500ml重悬，加入等体积2 X SDS电泳上样缓冲液，100°C煮沸5分钟，然后以12000g 离心1分钟，在12% SDS聚丙烯酰胺凝胶中各加入20 μ本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种多疣壁虎Ｈｏｘｃ１０蛋白的体外表达及多克隆抗体制备方法，其特征是：包括下列步骤：（１）多疣壁虎Ｈｏｘｃ１０的ＥＳＴ序列的获得：根据同源比对小鼠、人、鸡物种Ｈｏｘｃ１０基因序列，设计一对简并引物，序列如下：上游引物Ｆ： ５’－ＴＧＴＣＴＣＴＣＡＡＣＡＣＣＴＡＣＣＣＡＴＣ－３’；下游引物Ｒ： ５’－ ＧＴＴＣＴＣＣＣＫ（Ｇ／Ｔ）ＧＴＴＣＡＴＴＴＴＣＴ －３’ ，基因克隆获得多疣壁虎Ｈｏｘｃ１０的ＥＳＴ序列；（２）多疣壁虎Ｈｏｘｃ１０全长序列获得：ＲＡＣＥ法获得多疣壁虎Ｈｏｘｃ１０ 的５’ｃＤＮＡ和３’ｃＤＮＡ 序列，与ＥＳＴ序列拼接后得到多疣壁虎Ｈｏｘｃ１０全长序列，共包含２１５６ｂｐ，其ＯＲＦ区位于１１２－１２４２ｂｐ，共编码３７６个氨基酸；经生物学相关分析确认为多疣壁虎Ｈｏｘｃ１０基因，ＧｅｎＢａｎｋ登陆号：ＧＱ２６７５２８．１；（３）使用ＤＮＡ ＳＴＡＲ软件和ＳＷＩＳＳ－ＰＬＯＴ在线预测多疣壁虎Ｈｏｘｃ１０抗原表位，选取９６－１９１片段为免疫肽段，对应３９７－６８４核苷酸序列；（４）构建Ｈｏｘｃ１０的原核表达载体：设计构建Ｈｏｘｃ１０原核表达载体的引物，上游引物５’端加上ＸｈｏⅠ酶切位点及其保护碱基和补充碱基使其不出现移码，序列为：５’－ ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＣＡＡＣＴＣＣＣＣＴＣＣＴＧＣＴＣＴ－３’；下游引物在其５’端加上ＥｃｏＲⅠ酶切位点及其保护碱基和补充碱基使其不出现移码，序列为：５’－ ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＴＴＧＣＴＣＣＡＧＡＴＧＣＴＣ－３’；取多疣壁虎脑及脊髓组织，用Ｔｒｉｚｏｌ试剂法提取总ＲＮＡ； ＲＴ－ＰＣＲ扩增：用ＱＩＡＧＥＮ公司逆转录试剂盒及２μｇ总ＲＮＡ进行逆转录反应，合成ｃＤＮＡ；采用原核表达引物，以合成的ｃＤＮＡ为模板进行多疣壁虎Ｈｏｘｃ１０ 的对应蛋白表位优势肽段９６－１９１的３９７－６８４核苷酸序列， ＰＣＲ扩增；用限制性内切酶ＸｈｏⅠ、ＥｃｏＲⅠ消化Ｈｏｘｃ１０的ＰＣＲ产物和ｐＧＥＸ－４Ｔ１原核表达载体质粒，并进行酶切产物的胶回收；连接：用Ｔ４ ＤＮＡ连接酶将ＰＣＲ酶切回收产物和ｐＧＥＸ－４Ｔ１原核表达载体质粒的酶切回收产物连接；感受态细胞的制备：用无菌接种棒从－７０℃保存的ＤＨ５α菌株中蘸菌液划无氨苄青霉素ＬＢ琼脂板，３７℃培养过夜后挑取单个克隆接种于５ｍｌ ＬＢ培养基中，置细菌培养摇床中于３７℃、２５０转／分震荡培养１２小时；取０．５ｍｌ该菌液接种于无氨苄青霉素１００ｍｌ ＬＢ液体培养基中，３７℃震荡培养２－２．５小时，至ＯＤ６００为０．４－０．５时，放置于４℃冰箱冷却１－２小时；将培养液分入两个５０ｍｌ离心管中，４℃离心，４０００ｇ×１０分钟，弃去上清，用冰浴的０．１Ｍ ＭｇＣｌ２ ２５ｍｌ悬浮３０分钟；４℃离心，４０００ｇ×１０分钟，弃去上清，加入冰浴的０．１Ｍ ＣａＣｌ２－甘油溶液１ｍｌ悬浮；以１００μｌ／管分装入１．５ｍｌ离心管中，－７０℃冻存备用；重组质粒的转化：取５μｌ ＤＮＡ连接产物加入１００μｌ感受态细胞中，轻轻旋转数次使ＤＮＡ分散均匀，冰浴３０分钟，４２℃水浴中热休克９０秒，继续冰浴２－３分钟后加入ＬＢ培养基２００μｌ，于３７℃摇孵育６０分钟，将培养物涂于含氨苄青霉素的１．５％琼脂ＬＢ平板，待胶表面没有液体流动时，３７℃温箱倒置培养１２－１６小时；重组克隆的筛选及酶切鉴定：从上述培养板中挑取６个克隆接种于５ｍｌ含氨苄青霉素的ＬＢ培养基中，３７℃震荡培养过夜，以碱裂解法小量提取质粒ＤＮＡ，限制性内切酶消化１小时，电泳鉴定ＤＮＡ目的片断是否正确构建于表达载体中；将双酶切鉴定为阳性克隆的质粒进行测序鉴定，其测序结果序列与基因库中３９７－６８４核苷酸序列完全一致：１ ＣＡＡＣＴＣＣＣＣＴＣＣＴＧＣＴＣＴＴＴＣＣＣＧＡＣＣＡＡＴＧＴＣＡＡＧＧＡＡＧＡＡＡＡＴＧＣＣＴＧ ５１ ＣＴＧＣＡＴＧＴＡＣＡＡＣＧＣＡＧＡＣＡＡＡＡＧＧＧＣＴＡＡＡＡＡＣＧＣＣＡＣＣＧＡＧＧＣＧＡＣＣＣ１０１ ＴＣＴＡＣＣＣＣＡＧＴＣＡＧＡＴＧＣＣＴＧＡＡＴＣＴＴＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＣＣＡＴＧＡＡＧＴＣＣＣＣ１５１ ＧＴＧＣＣＣＡＧＣＴＡＣＴＡＣＣＧＣＧＣＣＡＧＣＣＡＡＧＧＴＴＡＴＴＣＣＴＣＣＡＴＧＧＡＧＡＡＧＧＣ２０１ ＧＴＣＣＡＡＣＴＧＣＡＡＣＡＡＣＣＣＧＡＣＣＧＡＧＴＴＴＧＡＧＧＣＡＡＣＴＴＴＣＧＡＡＣＣＣＡＧＧＧ２５１ ＣＧＡＧＣＣＴＣＡＧＣＣＡＧＡＧＧＡＧＴＧＡＧＣＡＴＣＴＧＧＡＧＣＡＡＣＣＧ；（５）目的蛋白的表达：制备ＢＬ２１感受态细胞；用鉴定正确的ｐＧＥＸ－４Ｔ１－Ｈｏｘｃ１０重组质粒转化ＢＬ２１感受态细胞，挑取含重组质粒的菌体单斑至含氨苄青霉素 ５０ｍｇ／Ｌ 的２ｍｌ ＬＢ培养基中３７℃震荡培养过夜；将１ｍｌ菌液加入到含５０ｍｌ ＬＢ培养基的１０００ｍｌ培养瓶中，３７℃震荡培养至ＯＤ６０...
【技术特征摘要】
1. 一种多疣壁虎HoxclO蛋白的体外表达及多克隆抗体制备方法，其特征是包括下列步骤(1)多疣壁虎HoxclO的EST序列的获得根据同源比对小鼠、人、鸡物种HoxclO基因序列，设计一对简并引物，序列如下上游引物 F: 5’-TGTCTCTCAACACCTACCCATC-3’ ；下游引物 R: 5' - GTTCTCCCK(G/T)GTTCATTTTCT _3’，基因克隆获得多疣壁虎HoxclO的EST序列；(2)多疣壁虎HoxclO全长序列获得RACE法获得多疣壁虎HoxclO的5，cDNA和3，cDNA序列，与EST序列拼接后得到多疣壁虎HoxclO全长序列，共包含2156bp，其ORF区位于112_1242bp，共编码376个氨基酸； 经生物学相关分析确认为多疣壁虎HoxclO基因，GenBank登陆号GQ267528. 1 ；(3)使用DNASTAR软件和SWISS-PLOT在线预测多疣壁虎HoxclO抗原表位，选取 96-191片段为免疫肽段，对应397-684核苷酸序列；(4)构建HoxclO的原核表达载体设计构建HoxclO原核表达载体的引物，上游引物5’端加上Bio I酶切位点及其保护碱基和补充碱基使其不出现移码，序列为5’- CCGGAATTCCAACTCCCCTCCTGCTCT-3’ ；下游引物在其5’端加上EcoR I酶切位点及其保护碱基和补充碱基使其不出现移码，序列为5’ - CCGCTCGAGCGGTTGCTCCAGATGCTC-3’ ； 取多疣壁虎脑及脊髓组织，用iTrizol试剂法提取总RNA ； RT-PCR扩增用QIAGEN公司逆转录试剂盒及2 μ g总RNA进行逆转录反应，合成cDNA ；采用原核表达引物，以合成的cDNA为模板进行多疣壁虎HoxclO的对应蛋白表位优势肽段96-191的397-684核苷酸序列，PCR 扩增；用限制性内切酶》io I ,EcoR I消化HoxclO的PCR产物和pGEX-4Tl原核表达载体质粒，并进行酶切产物的胶回收；连接用jM DNA连接酶将PCR酶切回收产物和PGEX-4T1原核表达载体质粒的酶切回收产物连接；感受态细胞的制备用无菌接种棒从-70°C保存的 DH5 α菌株中蘸菌液划无氨苄青霉素LB琼脂板，37°C培养过夜后挑取单个克隆接种于5ml LB培养基中，置细菌培养摇床中于37°C、250转/分震荡培养12小时；取0. 5ml该菌液接种于无氨苄青霉素IOOml LB液体培养基中，37°C震荡培养2-2. 5小时，至0D_为0. 4-0. 5 时，放置于4°C冰箱冷却1-2小时；将培养液分入两个50ml离心管中，4°C离心，4000gX 10 分钟，弃去上清，用冰浴的0. IM MgCl2 25ml悬浮30分钟；4°C离心，4000gX 10分钟，弃去上清，加入冰浴的0. IM CaCl2-甘油溶液Iml悬浮；以100 μ 1/管分装入1. 5ml离心管中，-70°C冻存备用；重组质粒的转化取5μ 1 DNA连接产物加入100 μ 1感受态细胞中，轻轻旋转数次使DNA分散均勻，冰浴30分钟，42°C水浴中热休克90秒，继续冰浴2_3分钟后加入LB培养基200 μ 1，于37°C摇孵育60分钟，将培养物涂于含氨苄青霉素的1. 5%琼脂LB 平板，待胶表面没有液体流动时，37°C温箱倒置培养12-16小时；重组克隆的筛选及酶切鉴定从上述培养板中挑取6个克隆接种于5ml含氨苄青霉素的LB培养基中，37°C震荡培养过夜，以碱裂解法小量提取质粒DNA，限制性内切酶消化1小时，电泳鉴定DNA目的片断是否正确构建于表达载体中；将双酶切鉴定为阳性克隆的质粒进行测序鉴定，其测序结果序列与基因库中397-684核苷酸序列完全一致1 CAACTCCCCTCCTGCTCTTTCCCGACCAATGTCAAGGAAGMAATGCCTG.51 CTGCATGTACAACGCAGACAAAAGGGCTAAAAACGCCACCGAGGCGACCC 101 TCTACCCCAGTCA...
【专利技术属性】
技术研发人员：顾星星，周晓芳，陈海莲，陆仁飞，
申请(专利权)人：南通大学，
类型：发明
国别省市：32
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