本发明专利技术公开了多疣壁虎Hoxc10蛋白的体外表达及多克隆抗体制备方法,包括多疣壁虎Hoxc10的EST序列的获得,RACE法获得Hoxc10全长序列,采用DNASTAR软件和SWISS-PLOT在线预测多疣壁虎Hoxc10蛋白的抗原表位,选取优势表位肽段构建Hoxc10的原核表达载体,体外诱导融合蛋白表达,融合蛋白的纯化及多克隆抗体的制备等步骤。本发明专利技术以pGEX-4T1为基础所构建的体外Hoxc10表达系统在BL21中能高效地表达目的蛋白,进一步进行纯化,可方便地获得大量的GST-Hoxc10融合蛋白,经此蛋白免疫新西兰大白兔所制备的兔源抗多疣壁虎Hoxc10抗血清滴度高、特异性好。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种多疣壁虎HoxclO蛋白的体外表达及多克隆抗体制备方法。
技术介绍
同源异型框基因(homeobox gene,Hox),编码一个高度保守的转录因子家系,这些转录因子在胚胎发育的形态发生中起关键作用,能够维持正常的体节形成,菱脑原节形成和发育,以及后脑和各个器官、组织及四肢的正常的分化和发育。HoxclO是Hox基因家族中一位重要的成员。已有研究表明,HoxclO不仅影响脊椎动物的胚胎发育,尤其是神经系统发育,同时也影响脊椎动物的断肢及尾部的再生过程。市场上多是针对小鼠、人及大鼠 HoxclO的抗体,这些抗体与羊、兔、猴等有一定的交叉反应,针对多疣壁虎的HoxclO蛋白高特异性、高滴度的抗体目前还没有。为进一步探究HoxclO在多疣壁虎断尾再生过程中的作用及其他相关生物学功能,本专利拟制备兔源抗多疣壁虎HoxclO抗体。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种能大量制备出高质量的抗多疣壁虎HoxclO蛋白抗体的多疣壁虎HoxclO蛋白的体外表达及多克隆抗体制备方法。本专利技术的技术解决方案是步骤1)、多疣壁虎HoxclO的EST序列的获得根据同源比对小鼠、人、鸡等物种HoxclO基因序列,设计一对简并引物,序列如下 上游引物 F: 5’-TGTCTCTCAACACCTACCCATC-3’ ; 下游引物 R: 5' - GTTCTCCCK(G/T)GTTCATTTTCT _3’, 基因克隆获得多疣壁虎HoxclO的EST序列。步骤2)、多疣壁虎HoxclO全长序列获得RACE法获得多疣壁虎HoxclO的5,cDNA和3,cDNA序列,与EST序列拼接后得到多疣壁虎HoxclO全长序列,共包含2156bp,其ORF区位于112_1242bp,共编码376个氨基酸。 经生物学相关分析确认为多疣壁虎HoxclO基因。GenBank登陆号GQ267528. 1步骤3)、使用DNA STAR软件和SWISS-PLOT在线预测多疣壁虎HoxclO抗原表位,通过综合分析发现HoxclO抗原表位极有可能位于氨基酸4-6,21-24,27,29-30, 36-42,45,57,7 2-73,78-81, 83-85, 99,131-132, 136,147-149,153-154,162-165,205-206,209,211,216-217, 226,233-234,240-241,271-274,295,301-302,308-310,337,370,372-373。本专利选取含有预测抗原表位较多的96-191片段为免疫肽段(对应397-684核苷酸序列)。步骤4)、构建HoxclO的原核表达载体1.设计构建HoxclO原核表达载体的引物,上游引物5’端加上B10 I酶切位点及其保护碱基和补充碱基使其不出现移码,序列为5’- CCGGAATTCCAACTCCCCTCCTGCTCT-3’ ;下游引物在其5’端加上EcoR I酶切位点及其保护碱基和补充碱基使其不出现移码,序列为5,- CCGCTCGAGCGGTTGCTCCAGATGCTC-3,; 2.取多疣壁虎脑,脊髓及部分其他组织,用Trizol试剂法提取总RNA ;3. RT-PCR扩增用 QIAGEN公司逆转录试剂盒及2 μ g总RNA进行逆转录反应,合成cDNA ;4.采用原核表达引物,以合成的cDNA为模板进行多疣壁虎HoxclO的397-684核苷酸序列(对应蛋白表位优势肽段96-191) PCR扩增;5.用限制性内切酶)(ho I、EcoR I消化HoxclO的PCR产物和PGEX-4T1原核表达载体质粒,并进行酶切产物的胶回收。6.连接用T4 DNA连接酶将 PCR酶切回收产物和PGEX-4T1原核表达载体质粒的酶切回收产物连接;7.感受态细胞的制备用无菌接种棒从_70°C保存的DH5 α菌株中蘸少许菌液划无氨苄青霉素LB琼脂板, 37°C培养过夜后挑取单个克隆接种于5ml LB培养基中,置细菌培养摇床中于37°C、250转/ 分震荡培养12小时。取0. 5ml该菌液接种于无氨苄青霉素IOOml LB液体培养基中,37°C 震荡培养2-2. 5小时,至OD6tltl为0. 4-0. 5时,放置于4°C冰箱冷却1_2小时。将培养液分入两个50ml离心管中,4°C离心,4000gX10分钟,弃去上清,用冰浴的0. IM MgCl2 25ml悬浮 30分钟。4°C离心,4000gX10分钟,弃去上清,加入冰浴的0. IM CaCl2-甘油溶液Iml悬浮。 以100 μ 1/管分装入1. 5ml离心管中,-70°C冻存备用。8.重组质粒的转化取5μ 1 DNA 连接产物加入100 μ 1感受态细胞中,轻轻旋转数次使DNA分散均勻,冰浴30分钟,42°C水浴中热休克90秒,继续冰浴2-3分钟后加入LB培养基200 μ 1,于37°C缓摇孵育60分钟, 将培养物适量涂于1. 5%琼脂LB平板(含氨苄青霉素),待胶表面没有液体流动时,37°C温箱倒置培养12-16小时;9.重组克隆的筛选及酶切鉴定从上述培养板中挑取6个克隆接种于5ml含氨苄青霉素的LB培养基中,37°C震荡培养过夜,以碱裂解法小量提取质粒DNA,限制性内切酶消化1小时,电泳鉴定DNA目的片断是否正确构建于表达载体中;10.将双酶切鉴定为阳性克隆的质粒进行测序鉴定,其测序结果序列与基因库中397-684核苷酸序列完全一致。 1 CAACTCCCCTCCTGCTCTTTCCCGACCAATGTCAAGGAAGAAAATGCCTG 51 CTGCATGTACAACGCAGACAAAAGGGCTAAAAACGCCACCGAGGCGACCC 101 TCTACCCCAGTCAGATGCCTGAATCTTGCCTCAGTGACCATGAAGTCCCC 151 GTGCCCAGCTACTACCGCGCCAGCCAAGGTTATTCCTCCATGGAGAAGGC 201 GTCCAACTGCAACAACCCGACCGAGTTTGAGGCAACTTTCGAACCCAGGG 251 CGAGCCTCAGCCAGAGGAGTGAGCATCTGGAGCAACCG步骤5)、目的蛋白的表达BL21感受态细胞的制备(方法同上述DH5ci感受态细胞的制备)。用鉴定正确的pGEX-4Tl-HoXC10重组质粒转化BL21感受态细胞,挑取含重组质粒的菌体单斑至anl LB培养基(含氨苄青霉素50mg/L)中37°C震荡培养过夜。将Iml菌液加入到含50ml LB培养基的IOOOml培养瓶中,37°C震荡培养至OD6tltl为0. 6左右,取Iml菌液作为未诱导的对照组,余下菌液中加入异丙基- β -D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0. 2 mm0l/L,3(TC诱导6小时。同时以转化了 pGEX_4Tl载体的BL21细菌作阴性对照。将诱导、 末诱导的含PGEX-4T1载体的BL21菌液各1ml,室温IOOOOg离心1分钟,弃去上清,0. OlM PBS 500ml重悬,加入等体积2 X SDS电泳上样缓冲液,100°C煮沸5分钟,然后以12000g 离心1分钟,在12% SDS聚丙烯酰胺凝胶中各加入20 μ本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种多疣壁虎Hoxc10蛋白的体外表达及多克隆抗体制备方法,其特征是:包括下列步骤:(1)多疣壁虎Hoxc10的EST序列的获得:根据同源比对小鼠、人、鸡物种Hoxc10基因序列,设计一对简并引物,序列如下:上游引物F: 5’-TGTCTCTCAACACCTACCCATC-3’;下游引物R: 5’- GTTCTCCCK(G/T)GTTCATTTTCT -3’ ,基因克隆获得多疣壁虎Hoxc10的EST序列;(2)多疣壁虎Hoxc10全长序列获得:RACE法获得多疣壁虎Hoxc10 的5’cDNA和3’cDNA 序列,与EST序列拼接后得到多疣壁虎Hoxc10全长序列,共包含2156bp,其ORF区位于112-1242bp,共编码376个氨基酸;经生物学相关分析确认为多疣壁虎Hoxc10基因,GenBank登陆号:GQ267528.1;(3)使用DNA STAR软件和SWISS-PLOT在线预测多疣壁虎Hoxc10抗原表位,选取96-191片段为免疫肽段,对应397-684核苷酸序列;(4)构建Hoxc10的原核表达载体:设计构建Hoxc10原核表达载体的引物,上游引物5’端加上XhoⅠ酶切位点及其保护碱基和补充碱基使其不出现移码,序列为:5’- CCGGAATTCCAACTCCCCTCCTGCTCT-3’;下游引物在其5’端加上EcoRⅠ酶切位点及其保护碱基和补充碱基使其不出现移码,序列为:5’- CCGCTCGAGCGGTTGCTCCAGATGCTC-3’;取多疣壁虎脑及脊髓组织,用Trizol试剂法提取总RNA; RT-PCR扩增:用QIAGEN公司逆转录试剂盒及2μg总RNA进行逆转录反应,合成cDNA;采用原核表达引物,以合成的cDNA为模板进行多疣壁虎Hoxc10 的对应蛋白表位优势肽段96-191的397-684核苷酸序列, PCR扩增;用限制性内切酶XhoⅠ、EcoRⅠ消化Hoxc10的PCR产物和pGEX-4T1原核表达载体质粒,并进行酶切产物的胶回收;连接:用T4 DNA连接酶将PCR酶切回收产物和pGEX-4T1原核表达载体质粒的酶切回收产物连接;感受态细胞的制备:用无菌接种棒从-70℃保存的DH5α菌株中蘸菌液划无氨苄青霉素LB琼脂板,37℃培养过夜后挑取单个克隆接种于5ml LB培养基中,置细菌培养摇床中于37℃、250转/分震荡培养12小时;取0.5ml该菌液接种于无氨苄青霉素100ml LB液体培养基中,37℃震荡培养2-2.5小时,至OD600为0.4-0.5时,放置于4℃冰箱冷却1-2小时;将培养液分入两个50ml离心管中,4℃离心,4000g×10分钟,弃去上清,用冰浴的0.1M MgCl2 25ml悬浮30分钟;4℃离心,4000g×10分钟,弃去上清,加入冰浴的0.1M CaCl2-甘油溶液1ml悬浮;以100μl/管分装入1.5ml离心管中,-70℃冻存备用;重组质粒的转化:取5μl DNA连接产物加入100μl感受态细胞中,轻轻旋转数次使DNA分散均匀,冰浴30分钟,42℃水浴中热休克90秒,继续冰浴2-3分钟后加入LB培养基200μl,于37℃摇孵育60分钟,将培养物涂于含氨苄青霉素的1.5%琼脂LB平板,待胶表面没有液体流动时,37℃温箱倒置培养12-16小时;重组克隆的筛选及酶切鉴定:从上述培养板中挑取6个克隆接种于5ml含氨苄青霉素的LB培养基中,37℃震荡培养过夜,以碱裂解法小量提取质粒DNA,限制性内切酶消化1小时,电泳鉴定DNA目的片断是否正确构建于表达载体中;将双酶切鉴定为阳性克隆的质粒进行测序鉴定,其测序结果序列与基因库中397-684核苷酸序列完全一致:1 CAACTCCCCTCCTGCTCTTTCCCGACCAATGTCAAGGAAGAAAATGCCTG 51 CTGCATGTACAACGCAGACAAAAGGGCTAAAAACGCCACCGAGGCGACCC101 TCTACCCCAGTCAGATGCCTGAATCTTGCCTCAGTGACCATGAAGTCCCC151 GTGCCCAGCTACTACCGCGCCAGCCAAGGTTATTCCTCCATGGAGAAGGC201 GTCCAACTGCAACAACCCGACCGAGTTTGAGGCAACTTTCGAACCCAGGG251 CGAGCCTCAGCCAGAGGAGTGAGCATCTGGAGCAACCG;(5)目的蛋白的表达:制备BL21感受态细胞;用鉴定正确的pGEX-4T1-Hoxc10重组质粒转化BL21感受态细胞,挑取含重组质粒的菌体单斑至含氨苄青霉素 50mg/L 的2ml LB培养基中37℃震荡培养过夜;将1ml菌液加入到含50ml LB培养基的1000ml培养瓶中,37℃震荡培养至OD60...
【技术特征摘要】
1. 一种多疣壁虎HoxclO蛋白的体外表达及多克隆抗体制备方法,其特征是包括下列步骤(1)多疣壁虎HoxclO的EST序列的获得根据同源比对小鼠、人、鸡物种HoxclO基因序列,设计一对简并引物,序列如下上游引物 F: 5’-TGTCTCTCAACACCTACCCATC-3’ ;下游引物 R: 5' - GTTCTCCCK(G/T)GTTCATTTTCT _3’,基因克隆获得多疣壁虎HoxclO的EST序列;(2)多疣壁虎HoxclO全长序列获得RACE法获得多疣壁虎HoxclO的5,cDNA和3,cDNA序列,与EST序列拼接后得到多疣壁虎HoxclO全长序列,共包含2156bp,其ORF区位于112_1242bp,共编码376个氨基酸; 经生物学相关分析确认为多疣壁虎HoxclO基因,GenBank登陆号GQ267528. 1 ;(3)使用DNASTAR软件和SWISS-PLOT在线预测多疣壁虎HoxclO抗原表位,选取 96-191片段为免疫肽段,对应397-684核苷酸序列;(4)构建HoxclO的原核表达载体设计构建HoxclO原核表达载体的引物,上游引物5’端加上Bio I酶切位点及其保护碱基和补充碱基使其不出现移码,序列为5’- CCGGAATTCCAACTCCCCTCCTGCTCT-3’ ;下游引物在其5’端加上EcoR I酶切位点及其保护碱基和补充碱基使其不出现移码,序列为5’ - CCGCTCGAGCGGTTGCTCCAGATGCTC-3’ ; 取多疣壁虎脑及脊髓组织,用iTrizol试剂法提取总RNA ; RT-PCR扩增用QIAGEN公司逆转录试剂盒及2 μ g总RNA进行逆转录反应,合成cDNA ;采用原核表达引物,以合成的cDNA为模板进行多疣壁虎HoxclO的对应蛋白表位优势肽段96-191的397-684核苷酸序列,PCR 扩增;用限制性内切酶》io I ,EcoR I消化HoxclO的PCR产物和pGEX-4Tl原核表达载体质粒,并进行酶切产物的胶回收;连接用jM DNA连接酶将PCR酶切回收产物和PGEX-4T1原核表达载体质粒的酶切回收产物连接;感受态细胞的制备用无菌接种棒从-70°C保存的 DH5 α菌株中蘸菌液划无氨苄青霉素LB琼脂板,37°C培养过夜后挑取单个克隆接种于5ml LB培养基中,置细菌培养摇床中于37°C、250转/分震荡培养12小时;取0. 5ml该菌液接种于无氨苄青霉素IOOml LB液体培养基中,37°C震荡培养2-2. 5小时,至0D_为0. 4-0. 5 时,放置于4°C冰箱冷却1-2小时;将培养液分入两个50ml离心管中,4°C离心,4000gX 10 分钟,弃去上清,用冰浴的0. IM MgCl2 25ml悬浮30分钟;4°C离心,4000gX 10分钟,弃去上清,加入冰浴的0. IM CaCl2-甘油溶液Iml悬浮;以100 μ 1/管分装入1. 5ml离心管中,-70°C冻存备用;重组质粒的转化取5μ 1 DNA连接产物加入100 μ 1感受态细胞中,轻轻旋转数次使DNA分散均勻,冰浴30分钟,42°C水浴中热休克90秒,继续冰浴2_3分钟后加入LB培养基200 μ 1,于37°C摇孵育60分钟,将培养物涂于含氨苄青霉素的1. 5%琼脂LB 平板,待胶表面没有液体流动时,37°C温箱倒置培养12-16小时;重组克隆的筛选及酶切鉴定从上述培养板中挑取6个克隆接种于5ml含氨苄青霉素的LB培养基中,37°C震荡培养过夜,以碱裂解法小量提取质粒DNA,限制性内切酶消化1小时,电泳鉴定DNA目的片断是否正确构建于表达载体中;将双酶切鉴定为阳性克隆的质粒进行测序鉴定,其测序结果序列与基因库中397-684核苷酸序列完全一致1 CAACTCCCCTCCTGCTCTTTCCCGACCAATGTCAAGGAAGMAATGCCTG.51 CTGCATGTACAACGCAGACAAAAGGGCTAAAAACGCCACCGAGGCGACCC 101 TCTACCCCAGTCA...
【专利技术属性】
技术研发人员:顾星星,周晓芳,陈海莲,陆仁飞,
申请(专利权)人:南通大学,
类型:发明
国别省市:32
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