表达鸡大肠杆菌外膜蛋白重组菌及其构建方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种表达鸡大肠杆菌外膜蛋白重组菌及其构建方法与应用。本发明专利技术表达鸡大肠杆菌外膜蛋白重组菌导入了鸡大肠杆菌外膜蛋白操纵子基因重组质粒，通过如下步骤构建：1鸡大肠杆菌外膜蛋白结构基因及各功能性基因的PCR扩增；2重组质粒的构建。此外，本发明专利技术还公开了一种鸡大肠杆菌重组菌外膜蛋白基因工程亚单位疫苗。本发明专利技术的表达鸡大肠杆菌外膜蛋白重组菌，其表达产物产量高，成本低，易于实现疫苗产业化生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物工程领域，具体涉及一种表达鸡大肠杆菌外膜蛋白重组菌及其构建方法。
技术介绍
鸡大肠杆菌病是由大肠埃希氏菌(Escherichia coll)的某些血清型菌株所引起的一种鸡的传染病。不同品种不同日龄的鸡都可发生。由于感染途径不同，临床主要表现为败血症、关节炎、心包炎、肝周炎、气囊炎、输卵管炎、腹膜炎、大肠杆菌肉芽肿和全眼球炎等多种病型。1885年Escherch首先发现大肠杆菌，1894年Ligniers系统报导了本病并分离出病原，在相当长的一段时间，大肠杆菌一直被认为是正常肠道菌群的组成部分，直到上世纪中叶才认识到一些特殊血清型的大肠杆菌对人和畜禽有病原性。随着养鸡业的发展，病原性大肠杆菌在各国的流行日益严重。此病在瑞典、荷兰、法国、匈牙利、保加利亚、美国、前苏联及其它养殖业发达的国家均有发生。随着我国养鸡业集约化程度的不断提高，该病不断地在我国蔓延和扩散，全国大部分省、市、自治区皆有报导。大肠杆菌致病性菌株的致病因子(或称毒力因子)主要由该病原体的三个特征确定：侵袭力、感染性和致病性潜力；其致病力因素则主要有细菌菌毛、毒素、外膜蛋白(Outer membrane protein,Omp)、铁转运系统等等。菌毛蛋白(或称粘着素、定居因子)、肠毒素、和外膜蛋白是大肠杆菌的主要毒力因子。研究表明，位于外膜外侧的鸡源大肠杆菌外膜蛋白能客观反映大肠杆菌分离株的遗传相关性，且在大肠杆菌致病机理及免疫机理中具有重要作用，致病株和非致病株毒力不同，可能是外膜蛋白的改变，由遗传因素造成。Omp可以加快巨噬细胞对抗原的摄取，激活淋巴细胞的增殖反应，刺激机体体液免疫，加强细胞免疫功能，从而抵抗同源菌和异源菌的攻击，这提示了其在预防疾病方面具有很大潜力，是一种重要的致病因子。在药物治疗方面，由于大量抗生素长期使用和滥用，致使耐药菌株越来越多，耐药谱不断扩展、产生耐药性的能力越来越强。使得药物控制难度越来越大，可供选择药物的空间也越来越小。这就给药物防治鸡大肠杆菌病带来很大的困难。因此研制有效的疫苗来预防鸡大肠杆菌病，越来越受到重视并被广泛的采用。由于鸡致病性大肠杆菌抗原结构复杂，血清型众多，不同血清型菌株之间缺乏完全交叉保护，加之不同地区的优势血清型又存在很大的差异。因此，解决此问题的关键在于找出禽大肠杆菌共同的保护性抗原，以制备对不同血清型菌株均有保护作用的疫苗，使用基因工程疫苗预防本病具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种表达鸡大肠杆菌外膜蛋白重组菌，以提高免疫的效果，降低防治鸡大肠杆菌疫苗的生产成本。本专利技术的另一目的是提供上述表达鸡大肠杆菌外膜蛋白重组菌的构建方法。本专利技术还有一目的是提供上述表达鸡大肠杆菌外膜蛋白重组菌在制备鸡大肠杆菌病免疫疫苗中的应用。本专利技术的再一目的是提供一种鸡大肠杆菌外膜蛋白基因工程亚单位疫苗。为达到上述目的，采用的技术方案如下：一种表达鸡大肠杆菌外膜蛋白重组菌，其导入了鸡大肠杆菌外膜蛋白操纵子基因重组质粒。其中，受体菌株为DH5α和BL21。上述表达鸡大肠杆菌外膜蛋白重组菌的构建方法，包括如下步骤：1、鸡大肠杆菌外膜蛋白结构基因及各功能性基因的PCR扩增；2、能够呈现表达鸡大肠杆菌外膜蛋白重组质粒的构建。其中，步骤1所述的鸡大肠杆菌外膜蛋白操纵子基因的PCR扩增包括如下步骤：A、引物的设计与合成；B、DNA片段的提取；C、鸡大肠杆菌外膜蛋白操纵子基因的扩增、连接、转化与表达。其中，步骤2所述的重组质粒的构建方法包括如下步骤：鸡大肠杆菌外膜蛋白操纵子基因的PCR扩增产物的连接、质粒构建和操纵子基因表达质粒的连接、构建与鉴定、以及表达的外膜蛋白的抗原制备。其中，步骤2中所使用的质粒为pUCm-T和pET-28a。表达鸡大肠杆菌外膜蛋白重组菌，在制备鸡大肠杆菌病免疫疫苗中的应用。一种鸡大肠杆菌外膜蛋白基因工程亚单位疫苗，它是通过如下方法制得：将表达鸡大肠杆菌外膜蛋白重组菌的表达产物与吐温-80按体积96:4混匀作为水相，白油与司班-80按体积94:6加热溶解作为油相，油相与水相按体积比3:1的比例乳化。本专利技术具有如下有益效果：本专利技术的表达鸡大肠杆菌外膜蛋白重组菌，其表达产物产量高，成本低，易于实现疫苗产业化生产。附图说明图1外膜蛋白C基因的PCR扩增产物电泳，其中，M泳道是核酸DNA Marker，L1为外膜蛋白C PCR扩增产物约1100bp。图2为质粒pUCm-C酶切电泳，其中，M泳道是核酸DNA Marker，L1为BamHI和HindIII双酶切结果。图3为pET-C酶切电泳，其中，M泳道是核酸DNA Marker，L1为BamHI和HindIII双酶切结果。图4为pET-C蛋白电泳，其中，泳道M为低分子量蛋白Marker，泳道L1、L2为pET-C，泳道L3、L4为空质粒pET-28a。图5为pET-C表达蛋白在大肠杆菌中的分布蛋白电泳，其中，泳道M为低分子量蛋白Marker，泳道L1为pET-C可溶性形式存在，泳道L2为pET-C包涵体形式存在。图6为外膜蛋白C基因表达产物的Western blot分析，其中L1为空质粒对照，L2为pET-C表达蛋白，M为Marker。具体实施方式以下实施例中使用的材料如下：1、宿主菌：受体菌株DH5α和BL21。2、质粒：pUCm-T和pET-28a。实施例1：鸡大肠杆菌外膜蛋白操纵子基因的PCR扩增1、引物设计与合成根据GenBank公布的鸡源外膜蛋白C基因全序列设计了一对引物PO1，PO2。PO1，PO2引物中分别含有BamHI和HindIII酶切位点，引物序列如下：PO1：5'-CGCGGATCCAACATGAAAGTTAAAGTACTGTCCCTC-3'BamHIPO2：5'-CCCAAGCTTTTAGAACTGGTAAACCAGGCC-3'HindIII2、模版的制备将鸡大肠杆菌单菌株用LB培养基扩增培养，提取基因组，作为模板。3、PCR反应体系及扩增条件PCR反应在50μL体系中进行，10×Buffer 5.0μL，dNTP 4.0μL，PO12.0μL，PO22.0μL，DNA模板1μL，Taq酶0.5μL，双蒸水35.5μL。混匀后按下列条件PCR扩增：94℃5min，94℃1min，45℃1min，72℃2min，共进行30个循环，再72℃本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种表达鸡大肠杆菌外膜蛋白重组菌，其特征在于所述菌株导入了鸡大肠杆菌外膜蛋白操纵子基因重组质粒。

【技术特征摘要】
1.一种表达鸡大肠杆菌外膜蛋白重组菌，其特征在于所述菌株导入了鸡大肠杆
菌外膜蛋白操纵子基因重组质粒。
2.根据权利要求1所述的表达鸡大肠杆菌外膜蛋白重组菌，其特征在于所述的
菌株为DH5α和BL21。
3.一种权利要求1所述的表达鸡大肠杆菌外膜蛋白重组菌的构建方法，其特征
在于它包括如下步骤：
(1)鸡大肠杆菌外膜蛋白结构基因及操纵子基因的PCR扩增；
所述的鸡大肠杆菌外膜蛋白操纵子基因的PCR扩增包括如下步骤：
(a)引物的设计与合成；
(b)染色体的提取；
(c)鸡大肠杆菌外膜蛋白操纵子基因的分段扩增、连接、转化与表达；
(2)能够呈现表达外膜蛋白重组菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：王连民，刘珂飞，孙珊珊，
申请(专利权)人：天津生机集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12