一种提高地衣芽胞杆菌外源蛋白分泌水平的方法技术

本发明专利技术公开了一种提高地衣芽胞杆菌外源蛋白分泌水平的方法，包括步骤：S1，构建信号肽肽酶SppA整合载体，导入地衣芽胞杆菌中，通过同源单双交换，过表达信号肽肽酶SppA，从而得到地衣芽胞杆菌整合菌株；S2，将外源蛋白的表达质粒电转入S1所述地衣芽胞杆菌整合菌株中，从而得到地衣芽胞杆菌外源蛋白表达菌株；S3，将S2所述地衣芽胞杆菌外源蛋白表达菌株于种子培养基中进行活化，得到活化的种子液；S4，将S3中所述种子液于相应外源蛋白液体发酵培养基中进行发酵，即可提高所述外源蛋白分泌水平。本发明专利技术中地衣芽胞杆菌过表达信号肽肽酶SppA后其外源蛋白的分泌量显著提高，说明对地衣芽胞杆菌过表达信号肽肽酶SppA可以有效提高其外源蛋白的分泌水平。

Method for improving secretion level of exogenous protein of Bacillus licheniformis

The invention discloses a method for improving the level of foreign protein, the secretion of Bacillus licheniformis S1, comprising the steps of: Construction of signal peptide peptidase SppA integration vector, introduction of Bacillus licheniformis, through homologous single and double exchange, over expression of signal peptide peptidase SppA, resulting in lichens Bacillus strains bud S2, the expression of integration; the plasmid of exogenous protein electroporated into S1 of the Bacillus licheniformis integration strains, resulting in Bacillus licheniformis heterologous protein expression strain; S3, S2 of the Bacillus licheniformis heterologous protein expression in the seed culture medium for strain activation, activation of S4 by seed liquid; S3, the seed liquid in the corresponding exogenous protein liquid fermentation of fermentation medium, can increase the secretion of heterologous protein level. The secretion of heterologous protein from Bacillus licheniformis in the invention of over expression of signal peptide peptidase SppA significantly increased, that of Bacillus licheniformis over expression of signal peptide peptidase SppA can effectively improve the secretion of heterologous protein.

【技术实现步骤摘要】
一种提高地衣芽胞杆菌外源蛋白分泌水平的方法
技术介绍
地衣芽胞杆菌是近年来被广泛研究的一种革兰氏阳性菌，广泛存在于自然界中，是公认的生物安全性菌株(GRAS)，具有遗传背景清晰，遗传操作简便等特点。其发酵后可以合成多种生物化工产品(聚γ-谷氨酸，杆菌肽，乙偶姻，2,3-丁二醇等)。与此同时，地衣芽胞杆菌具有良好的外源蛋白分泌能力，可作为一种优良的宿主菌用于外源蛋白的生产。在地衣芽胞杆菌外源蛋白分泌过程中，前体蛋白经过信号肽酶的剪切作用后从而分泌到胞外，而信号肽则残留于细胞膜上，而抑制了前体蛋白进一步分泌到胞外，影响蛋白分泌水平。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供了一种提高地衣芽胞杆菌外源蛋白分泌效率的方法。所述方法是在在地衣芽胞杆菌的基础上，通过过表达信号肽肽酶SppA，得到信号肽肽酶过表达菌株，所述菌株能有效提高外源蛋白的分泌量。本专利技术的技术方案为：一种提高地衣芽胞杆菌外源蛋白分泌水平的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：S1，构建信号肽肽酶SppA整合载体，导入地衣芽胞杆菌中，通过同源单双交换，过表达信号肽肽酶SppA，从而得到地衣芽胞杆菌整合菌株；S2，将外源蛋白的表达质粒电转入S1所述地衣芽胞杆菌整合菌株中，从而得到地衣芽胞杆菌外源蛋白表达菌株；S3，将S2所述地衣芽胞杆菌外源蛋白表达菌株于种子培养基中进行活化，得到活化的种子液；S4，将S3中所述种子液于相应外源蛋白液体发酵培养基中进行发酵，即可提高所述外源蛋白分泌水平。过表达地衣芽胞杆菌中信号肽肽酶SppA的具体步骤为：1)采用PCR的方法扩增出信号肽肽酶sppA基因所需的上下游同源臂；2)所述上下游同源臂片段回收纯化后，进行SOE-PCR并回收纯化，酶切，并与相同酶酶切的整合表达质粒T2(2)-Ori连接，并进行PCR验证，得到信号肽肽酶SppA整合载体；3)将所述信号肽肽酶SppA整合载体转入地衣芽胞杆菌中。所述地衣芽胞杆菌为地衣芽胞杆菌BL10，所述地衣芽胞杆菌BL10(BacilluslicheniformisBL10)保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCCNO：M2013400，保藏日期为：2013年9月10日，保藏地址为：中国武汉大学。所述信号肽肽酶sppA基因的DNA序列表为序列表中的SEQIDNO:1。所述外源蛋白包括淀粉酶、纳豆激酶、甘露聚糖酶中的一种。所述淀粉酶、纳豆激酶、甘露聚糖酶的液体发酵培养基分别对应为淀粉酶液体发酵培养基、纳豆激酶液体发酵培养基和甘露聚糖酶液体发酵培养基。一种淀粉酶液体发酵培养基，其特征在于，所述淀粉酶液体发酵培养基的成分为：5～8g/L玉米浆；5～8g/L酵母粉；6～12g/L蛋白胨；8～14g/L柠檬酸钠；2～3g/L一水合磷酸氢二钾；0.5～2g/L七水合硫酸镁及余量的水；所述淀粉酶液体发酵培养基pH7.0～7.2。一种纳豆激酶液体发酵培养基，其特征在于，所述纳豆激酶液体发酵培养基的成分为：10～30g/L葡萄糖；5～20g/L蛋白胨；10～25g/L酵母粉；5～15g/L大豆蛋白胨；5～12g/L氯化钠；3～12g/L硫酸铵及余量的水；所述纳豆激酶液体发酵培养基pH7.0～7.2。一种甘露聚糖酶液体发酵培养基，其特征在于，所述甘露聚糖酶液体发酵培养基的成分为：15～30g/L魔芋粉；15～35g/L豆粕；3～8g/L玉米浆；3～8g/L硫酸铵；1～3g/L一水合磷酸二氢钾及余量的水；所述甘露聚糖酶液体发酵培养基pH7.0～7.4。所述淀粉酶的表达质粒为pHY-amyL；所述纳豆激酶的表达质粒为pP3SacCNK；所述甘露聚糖酶的表达质粒为pHY-manA。本专利技术的技术效果为：本专利技术通过过表达地衣芽胞杆菌中信号肽肽酶SppA，信号肽肽酶SppA高效溶解地衣芽胞杆菌细胞膜上被信号肽酶切割后残留的信号肽，从而打通地衣芽胞杆菌源蛋白分泌至胞外的通道，所述方法以淀粉酶、纳豆激酶、甘露聚糖酶为目标蛋白进行研究，发现地衣芽胞杆菌过表达信号肽肽酶SppA后其外源蛋白的分泌量显著提高，分别提高了70％，33％，48.8％，说明对地衣芽胞杆菌过表达信号肽肽酶SppA可以有效提高其外源蛋白的分泌水平；另外本专利技术所述的外源蛋白发酵培养基营养有效全面，能辅助提高地衣芽胞杆菌外源蛋白分泌水平。附图说明图1：sppA过表达载体的构件图(上下游同源臂扩增图)；其中，泳道1，2：整合基因sppA所扩增的上下游同源臂A和B；泳道3：5KDNAmarker(从上到下依次为：5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)。图2：整合载体转化地衣芽胞杆菌BL10菌落PCR验证图；其中，泳道1：载体构建中的菌落PCR验证胶图，泳道2：5Kmarker(从上到下依次为：5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)，PCR验证所用引物为载体上的验证引物T2-F/R。图3：地衣芽胞杆菌BL10中整合sppA的验证胶图；其中，泳道1：野生菌的双交换验证的菌落PCR胶图，泳道2：工程菌的双交换验证的菌落PCR胶图，泳道3：5Kmarker(从上到下依次为：5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)，PCR验证所用引物为双交换验证引物GsppA-KYF/KYR。图4：淀粉酶表达质粒pHY-amyL转化地衣芽胞杆菌BL10(sppA)菌落PCR验证图；其中，泳道1：5Kmarker(从上到下依次为：5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)；泳道2：淀粉酶质粒转化BL10(sppA)菌落PCR验证图。图5：纳豆激酶表达质粒pP3SacCNK转化地衣芽胞杆菌BL10(sppA)菌落PCR验证图；其中，泳道1：5Kmarker(从上到下依次为：5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)；泳道3：纳豆激酶质粒转换BL10(sppA)菌落PCR验证图。图6：甘露聚糖酶表达质粒pHY-manA转化地衣芽胞杆菌BL10(sppA)菌落PCR验证图；其中，泳道1：5Kmarker(从上到下依次为：5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)；泳道4：甘露聚糖酶质粒转换BL10(sppA)菌落PCR验证图。图7：地衣芽胞杆菌BL10(sppA)/pHY-amyL与原始菌发酵终点测定淀粉酶酶活力柱状图。图8：地衣芽胞杆菌BL10(sppA)/pP43SacCNK与原始菌发酵终点测定纳豆激酶酶活力柱状图。图9：地衣芽胞杆菌BL10(sppA)/pHY-manA与原始菌发酵终点测定甘露聚糖酶酶活力柱状图。具体实施方式结合以下实例，对本专利技术进行进一步说明：本专利技术所述实施例所用地衣芽胞杆菌为地衣芽胞杆菌BL10，所述地衣芽胞杆菌BL10的拉丁文分类命名为Bacilluslicheniformi本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提高地衣芽胞杆菌外源蛋白分泌水平的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：S1，构建信号肽肽酶SppA整合载体，导入地衣芽胞杆菌中，通过同源单双交换，过表达信号肽肽酶SppA，从而得到地衣芽胞杆菌整合菌株；S2，将外源蛋白的表达质粒电转入S1所述地衣芽胞杆菌整合菌株中，从而得到地衣芽胞杆菌外源蛋白表达菌株；S3，将S2所述地衣芽胞杆菌外源蛋白表达菌株于种子培养基中进行活化，得到活化的种子液；S4，将S3中所述种子液于相应外源蛋白液体发酵培养基中进行发酵，即可提高所述外源蛋白分泌水平。

【技术特征摘要】
1.一种提高地衣芽胞杆菌外源蛋白分泌水平的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：S1，构建信号肽肽酶SppA整合载体，导入地衣芽胞杆菌中，通过同源单双交换，过表达信号肽肽酶SppA，从而得到地衣芽胞杆菌整合菌株；S2，将外源蛋白的表达质粒电转入S1所述地衣芽胞杆菌整合菌株中，从而得到地衣芽胞杆菌外源蛋白表达菌株；S3，将S2所述地衣芽胞杆菌外源蛋白表达菌株于种子培养基中进行活化，得到活化的种子液；S4，将S3中所述种子液于相应外源蛋白液体发酵培养基中进行发酵，即可提高所述外源蛋白分泌水平。2.根据权利要求2所述的一种提高地衣芽胞杆菌外源蛋白分泌水平的方法，其特征在于，过表达地衣芽胞杆菌中信号肽肽酶SppA的具体步骤为：1)采用PCR的方法扩增出信号肽肽酶sppA基因所需的上下游同源臂；2)所述上下游同源臂片段回收纯化后，进行SOE-PCR并回收纯化，酶切，并与相同酶酶切的整合表达质粒T2(2)-Ori连接，并进行PCR验证，得到信号肽肽酶SppA整合载体；3)将所述信号肽肽酶SppA整合载体转入地衣芽胞杆菌中。3.根据权利要求2中所述提高地衣芽胞杆菌外源蛋白分泌水平的方法，其特征在于，所述地衣芽胞杆菌为地衣芽胞杆菌BL10，所述地衣芽胞杆菌BL10保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCCNO：M2013400。4.根据权利要求3所述的一种提高地衣芽胞杆菌外源蛋白分泌水平的方法，其特征在于，所述信号肽肽酶sppA基因的DNA序列表为序列表中的SEQIDNO:1。5.根据根据权利要求1所述的一种提高地衣芽胞杆菌外源蛋白分泌水平的方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈守文，王豪，蔡冬波，何鹏辉，朱江，魏雪团，朱程军，
申请(专利权)人：湖北大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42