本发明专利技术提供了一种表达和纯化RANK胞外区域蛋白的方法。该方法包括：(1)构建具有编码RANK胞外区域的cDNA的载体，将该载体转化到原核细胞中，从而得到以包涵体形式表达的重组RANK；(2)对该包涵体进行超声处理，然后重新溶解在6M的盐酸胍中，得到解离状态的重组RANK；(3)重新折叠重组RANK；(4)将上清液利用琼脂75柱进行分离；(5)通过SDS-PAGE收集并分析正确折叠的RANK。本发明专利技术提供的方法尤其适用于鼠RANK胞外区域蛋白的表达与纯化。
【技术实现步骤摘要】
表达和纯化RANK胞外区域蛋白的方法本申请是基于申请日为2009年3月26日、申请号为200910080733.X、专利技术创造名称为“鼠RANK/RANKL胞外复合体的晶体，制备其的方法及其应用”专利申请的分案申请。
本专利技术涉及纯化和表达RANK胞外蛋白的方法，还提供了一种RANK/RANKL复合体的晶体，尤其提供了一种鼠RANK/RANKL胞外蛋白形成的晶体。本专利技术提供了一种制备鼠RANK/RANKL胞外复合体晶体的方法，以及该复合体结构在医药领域中的应用。
技术介绍
肿瘤坏死因子(TNF)家族中的细胞因子在诸如炎症反应、器官发生、宿主防御、自身免疫和细胞凋亡等多种生物功能中扮演着重要的角色。这些生物调节因子是通过受体-配体相互作用，从而引发细胞内的信号传递以及细胞表型的改变而发挥相应的生理作用的。作为TNF家族成员的RANKL以及其受体RANK在生物体内的多种活动中扮演着重要的角色，其对于骨的重塑过程起到了重要的调节作用，并且RANK以及RANKL分子之间的相互作用还可调节T细胞/树突状细胞的信号传导、树突状细胞的存活以及淋巴组织的发育，近年来受到了广泛的关注。在人体骨的重塑过程中，破骨细胞是骨重塑的“启动子”，成骨细胞是骨重塑的“调节者”，骨吸收类疾病共同的病理特征为破骨细胞调节异常导致骨形成和骨吸收之间丧失平衡，因此深入了解破骨细胞的激活机制将对于成功防治骨吸收类疾病的发生有着至关重要的意义。1997年，几个不同的研究小组发现了肿瘤坏死因子受体-配体超家族新成员：骨保护蛋白(osteoprotegerin,OPG)、RANKL以及RANK；随后，多项研究相继显示：RANKL、OPG具有调节破骨细胞分化、发育、影响其功能的作用，RANK是RANKL、OPG发挥作用的关键，它们形成一个骨调节轴，来调节骨的重塑过程。RANKL为一种II型跨膜蛋白，其多为三个单体聚合成的复合体，主要分布在活化T细胞、骨髓基质细胞及成骨细胞等细胞中，目前认为哺乳动物中存在三种RANKL蛋白：RANKL1、RANKL2、RANKL3，其中前两种为膜结合蛋白，后一种为被分泌到胞外的可溶性蛋白。人和大鼠的RANKL分子分别包含317、316个氨基酸残基，具有87％的同源性；人类RANKL基因位于13q14，其启动子区包含成骨细胞分化的关键转录因子cbaf-1的活性。RANKLmRNA可在多种组织表达，以骨骼和淋巴组织中最高，在骨骼中，RANKL主要表达于骨小梁和骨髓；在骨髓基质细胞和成骨细胞均可检测到RANKLmRNA。2004年ItoS等人以及国际专利申请NO.WO03/014077都披露了RANKL的三维结构，其全部内容结合于此作为参考。各项研究表明：每一个RANKL单体包括一个夹层结构，其由两个平面反平行β-折叠片层构成。第一个片层由β-链A”、A、H、C及F组成，第二个片层由B’、B、G、D及E组成，其中第一片层为内层β-片层，该片层富含疏水性氨基酸，并通过疏水作用与另外两个RANKL相互结合，而B’、B、G、D及E链形成外层β-片层，该片层多为带电及极性氨基酸，负责与受体RANK结合；每一个RANKL单体中的β-夹层结构的一个边缘、链E及F包裹相邻单体的AHCFβ-片层的内部疏水层从而形成RANKL三聚体结构。RANKL三聚体的晶体结构特征是：具有P212121的空间群，晶胞参数为以及空间群R3，胞晶为其形状就像被截平了的锥形，靠近膜的一端宽于远端的顶点处。RANKL三聚体高底部直径约为顶点处的直径约为RANK是RANKL的受体，属于TNF受体家族，是一种I型跨膜蛋白，人RANK分子在破骨细胞前体细胞和成熟破骨细胞内表达量较高。RANK基因定位于18q22.1，其编码的蛋白质在体内以跨膜蛋白型存在，其表达于单核-巨噬细胞系、破骨细胞前体细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、树突状细胞等，表达于破骨细胞前体细胞膜表面的RANK介导RANKL的信号，发挥调节破骨细胞分化的功能。当配体RANKL与受体RANK的胞外区域结合后，导致了RANK的激活，活化后的RANK通过其胞内区域的TRAF结合域与TRAF1、2、3、5、6等蛋白结合，并且通过这些TRAF蛋白激活细胞内的两条重要的信号通路：JNK/SAPK通路和NFκB信号通路。这两条信号通路的激活诱导了与破骨细胞分化相关的基因的表达，最终促进了破骨细胞的分化与成熟。而且，各种骨代谢调节因子、激素参与RANKL-RANK-OPG轴信号的调节。与其它信号途径一样，RANKL-RANK-OPG轴信号也存在正反馈和负反馈调节。1α,25-(OH)2D3、甲状旁腺素、前列腺素E2、白介素1、IL-6等骨吸收因子分别通过维生素D受体介导通路、蛋白激酶A介导通路、gp130/STAT介导通路上调成骨细胞/骨髓基质细胞RANKLmRNA表达；IL-1、TNF-α分别通过激活破骨细胞表面的IL-1R和TNFR1加强RANKL信号；TGF-β则可增加破骨细胞表面的RANK上调RANKL信号。作为RANKL-RANK-OPG信号系统调控破骨细胞分化的中心环节，RANKL与RANK之间的相互作用及其促使RANK活化的微观机制一直以来是骨吸收类疾病研究领域的热点问题。其焦点问题之一是RANKL、RANK蛋白以及RANKL-RANK复合体的晶体结构。虽然目前已经获得了RANKL蛋白的晶体结构，但是仍然没有获得RANK蛋白以及RANK/RANKL复合体的晶体结构，正是由于对该结构的认识不足，所以学者们对于RANKL-RANK-OPG信号体系如何被调控，以及受调控后RANKL-RANK-OPG执行信号传递的微观机制尚无明确的认识。这严重影响了有关骨吸收类疾病致病机制的探索以及抗骨吸收药物的研究。分析目前还未获得RANK蛋白以及RANKL-RANK复合体的晶体结构的原因主要有以下两点：1.RANK蛋白较难于制备和纯化。在RANK被发现至今的时间里，一直无RANK蛋白E.coli表达以及纯化的相关报道。2.相对于包含RANKL在内的TNF蛋白家族成员所具有的较刚性的结构，包括RANK在内的TNFR蛋白家族成员其结构具有较大的可变性，因而更难于获得结晶。
技术实现思路
本专利技术提供了一种蛋白复合体晶体，其中所述复合体包括鼠RANK/RANKL胞外区域蛋白的氨基酸序列。所述鼠RANKL的胞外区域是指所述RANKL单体C-末端从161位氨基酸至316位氨基酸，所述RANK的胞外区域是指所述RANK单体N-末端从26位氨基酸至210位氨基酸。根据本专利技术提供的鼠RANK/RANKL复合体晶体中，所述晶体属于P63六边形空间群组，晶胞尺寸是和在本专利技术提供的晶体中，该复合体包括由三个RANKL单体链形成的三聚体内核，以及另三个RANK单体链。RANK单体链分别结合在RANKL三聚体内核上，从而形成六聚体。每个RANK受体结合到由相邻两个RANKL配体亚单位形成的裂缝中；该六聚体复合体具有的溶剂可及表面积，由RANK贡献RANKL贡献在本专利技术提供的晶体中，RANK单体链的环120S(即残基122-127)完全与配体RANKL结合，在RANK单体链的两个区域，即残基182-185，以及残基194-196形成2个短的β-片层构象本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种表达和纯化RANK胞外区域蛋白的方法，包括：(1)构建具有编码RANK胞外区域的cDNA的载体，将所述载体转化到原核细胞中，从而得到以包涵体形式表达的重组RANK；(2)对所述包涵体进行超声处理，然后重新溶解在6M的盐酸胍中，得到解离状态的所述重组RANK；(3)重新折叠所述重组RANK，所述重新折叠的过程包括：将所述包涵体稀释在包含20mM、pH值为7.3的Na2HPO4、1M L‑精氨酸、20％甘油、10mM还原型谷胱苷肽以及1mM氧化型谷胱苷肽的复性(IB)溶液中，得到第一复性液；将所述第一复性液稀释在含有20mM、pH值为7.3的Na2HPO4、0.5M L‑精氨酸、10％甘油的重新折叠缓冲液1中4℃下透析12小时，得到第二复性液；将所述第二复性液稀释在含有20mM、pH值为7.3的Na2HPO4、0.2M L‑精氨酸、5％甘油的重新折叠缓冲液2中4℃下透析12小时，得到第三复性液；将所述第三复性液稀释在20mM、pH值为7.3的Na2HPO4、0.2M L‑精氨酸中4℃下透析12小时，得到第四复性液；将所述第四复性液离心，得上清液；(4)将所述上清液利用琼脂75柱进行分离；(5)通过SDS‑PAGE收集并分析正确折叠的RANK。...
【技术特征摘要】
1.一种表达和纯化RANK胞外区域蛋白的方法，包括：(1)构建具有编码RANK胞外区域的cDNA的载体，将所述载体转化到原核细胞中，从而得到以包涵体形式表达的重组RANK；所述RANK的胞外区域是指鼠RANK单体N-末端从26位氨基酸至210位氨基酸的区域；所述鼠RANK单体的氨基酸序列为：MAPRARRRRQLPAPLLALCVLLVPLQVTLQVTPPCTQERHYEHLGRCCSRCEPGKYLSSKCTPTSDSVCLPCGPDEYLDTWNEEDKCLLHKVCDAGKALVAVDPGNHTAPRRCACTAGYHWNSDCECCRRNTECAPGFGAQHPLQLNKDTVCTPCLLGFFSDVFSSTDKCKPWTNCTLLGKLEAHQGTTESDVVCSSSMTLRRPPKEAQAYLPSLIVLLLFISVVVVAAIIFGVYYRKGGKALTANLWNWVNDACSSLSGNKESSGDRCAGSHSATSSQQEVCEGILLMTREEKMVPEDGAGVCGPVCAAGGPWAEVRDSRTFTLVSEVETQGDLSRKIPTEDEYTDRPSQPSTGSLLLIQQGSKSIPPFQEPLEVGENDSLSQCFTGTESTVDSEGCDFTEPPSRTDSMPVSPEKHLTKEIEGDSCLPWVVSSNSTDGYTGSGNTPGEDHEPFPGSLKCGPLPQCAYSMGFPSEAAASMAEAGVRPQDRADERGASGSGSSPSDQPPASGNVTGNSNSTFISSG...
【专利技术属性】
技术研发人员：唐佩福，刘长振，黄鹏，张世谦，高斌，
申请(专利权)人：中国人民解放军总医院，北京表源生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11
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