一种斑马鱼高脂血症模型的建立方法及其应用技术

本发明专利技术涉及一种斑马鱼高脂血症模型的构建方法，并利用该动物模型进行高血脂疾病研究以及筛选降血脂药物。模型的构建方法主要包括：斑马鱼选取，用蛋黄粉喂养斑马鱼，斑马鱼组织化学染色或荧光染色，图像分析和/或微孔板分析，统计学分析几个步骤。本发明专利技术的方法具有简便、快速、经济、高效、高通量等优点，本模型可用于高血脂疾病研究以及筛选降血脂药物。本发明专利技术对加快降血脂药物的研发及改善高脂血症患者的治疗具有意义重大。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物模型构建领域，具体涉及一种斑马鱼高脂血症模型的建立方法及其应用。
技术介绍
脂肪代谢或运转异常使血浆一种或多种脂质高于正常的疾病称为高脂血症。高脂血症是一种全身性疾病，指血中胆固醇(TC)和/或甘油三酯(TG)过高或高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)过低，现代医学称之为血脂异常[1]。大量的流行病学调查和研究表明，高脂血症是动脉粥样硬化、冠心病和脑血管病发病的最重要危险因素。高脂血症也是高血压、糖耐量异常、糖尿病的一个重要危险因素。 高脂血症还可导致脂肪肝、肝硬化、胆石症、胰腺炎、眼底出血、失明、周围血管疾病、跛行、高尿酸血症[1]。根据近年卫生部在全国范围内进行的中国居民营养与健康状况调查显示，18岁以上居民总患病率为18.6%，全国患者总人数达1.6亿。降脂药可降低这些疾病的发生率和死亡率，对心脑血管疾病的防治产生积极、深远的影响。目前临床应用和处在研发阶段的降脂药物按其降脂机理和化学结构可分为他汀类，烟酸类，贝特类，胆酸鳌合剂类，多烯类，中药类等；但现有的降脂药物存在着或疗效不佳，或毒副作用较大或费用高等问题，因此开发新的降脂药物显得非常必要[2]。研发新的降脂药物是目前国际国内新药研发的热点和难点，选择理想的高脂血症动物模型是降脂药物研发成功的关键。目前用于高脂血症的体外模型主要是利用参与高脂血症形成的细胞，例如巨噬细胞，在高脂血症并发症动脉粥样硬化发生前，巨噬细胞会聚集在动脉，这个过程是在内皮粘附因子ICVM和ECVM促进下进行的。在低密度脂蛋白(LDL)作用下，巨噬细胞会变为泡沫细胞。可以利用这一过程进行降脂药物的筛选。目前研究表明他汀类药物可以抑制这一过程的发生。除了巨噬细胞外，T淋巴细胞，NK细胞，脂肪细胞，肝细胞，肥大细胞等都可以用来筛选降血脂药物[3]。但细胞培养体系的建立耗时较长，方法不稳定，重复性差，并且体外细胞缺少药物在生物整体的代谢转化和体内的循环分布，不能反映药物在体内的真实情况。目前用于高脂血症模型的动物有大鼠、小鼠、兔、金黄地鼠、豚鼠、悬猴、非洲绿猴以及恒河猴等，其他还有用鹌鹑、鸡、鸽子建立高脂血症模型。这些动物高脂血症模型的建立方法主要是利用高脂饲料如胆固醇、猪油、胆酸钠、蛋黄粉等喂养动物。虽然上述造模方法效果较好，但耗时较长，花费大，不适于高通量快速筛选[3]。建立一种能很好的模拟药物在体内的过程，又能快速方便的评价与筛选高脂血症治疗药物的动物模型具有重要的应用价值。斑马鱼是一种新颖的模式生物。与传统的体内和体外筛选模型相比较，活体斑马鱼筛选模型具有诸多优势，克服了原有体外模型在吸收、分布、代谢和排泄环节验证的欠缺及传统体内筛选模型实验周期长、操作复杂、成本高的弊端。斑马鱼是一种脊椎动物，与人类基因的相似度高达85%左右，实验结果可比性强。与鼠类等哺乳动物相比，斑马鱼胚胎透明，可同时观察分析多个器官，实验周期短，样本容量大，结果可信度高，所需费用低[4]。更重要的是，斑马鱼模型具有与生俱来的优点M:①饲养成本低，性成熟周期短；②繁殖能力强，一尾雌鱼每次可产200 300枚卵；③生长发育速度快，在受精后24小时，斑马鱼主要的组织器官基本已形成，可为研究提供大量的样本和较短的实验周期；④胚胎及幼鱼透明，体外受精，体外发育，可直接观察，并可同时分析多个器官系统；⑤胚胎有可以提供营养的卵黄囊，第一周内不需喂食，可避免化合物处理时化合物与食物成份的相互作用胚胎体积小，幼鱼体长只有I 4mm，能够在一个标准的6、12、24、48或96孔板内进行分析；⑦给药方式简单溶于水的小分子物质可直接经皮肤、鳃及消化系统进入斑马鱼体内；不溶于水的物质、大分子物质及蛋白质可进行显微注射。因此斑马鱼可作为很好的评价与筛选药物的高通量体内脊椎动物模型。国内外学者已经应用斑马鱼研究营养物质如脂类、糖类的代谢吸收。HOlttS-Vuori等[5’6]利用斑马鱼研究脂类的代谢。Konstantin等m利用斑马鱼研究脂类物质在血管内的聚集和氧化。Baek等M利用高胆固醇饲料喂食斑马鱼，建立高胆固醇模型，但是该文章中高胆固醇模型的建立耗时长，胆固醇分析使用裂解后的斑马鱼，检测过程繁琐，易出现假阳性或假阴性，不适于降脂药物筛选。Clifton等[9]利用斑马鱼荧光染料筛 选新的脂肪吸收抑制剂，在文章中作者提到用蛋黄粉和药物共同处理斑马鱼，之后进行脂肪染色，观察药物的抑制脂肪吸收效果；在该文中，作者并没有建立斑马鱼高脂血症模型，对实验结果也只是定性地观察，并没有建立药效学定量评价方法。鸡蛋黄粉是采用新鲜鸡蛋为原料，经过抽检验照，洗蛋、消毒、喷淋、吹干、打蛋、分离、过滤、均质、巴氏杀菌、喷雾、干燥等10多道工序制成，是新鲜鸡蛋的最为理想的替代品。在蛋黄粉中脂肪的含量> 60%，并且蛋黄粉具有较好的乳化性，是建立斑马鱼高脂血症模型的理性饲料(图I)。油红0(0il Red O)和尼罗红(nile red)都已经被证明是脂肪特异性染料，可以特异性地与脂肪结合，将脂肪染成红色(图2)。用油红O或和尼罗红对斑马鱼进行染色，斑马鱼血液中的脂肪含量越高，则染色后的血液就越红；斑马鱼血液中的脂肪含量越低，则染色后血液颜色就越浅[9a°]。
技术实现思路
为了克服上述现有技术的缺陷和不足，专利技术人经研究，旨在提供一种简单、快速、经济、高通量的斑马鱼模型体内快速筛选和评价降血脂药物的方法。本专利技术是通过以下技术方案实现的I. 一种斑马鱼高脂血症模型的建立方法，其特征在于，包括以下步骤(I)斑马鱼选取挑取发育正常的斑马鱼放入微孔板中；(2)用鸡蛋黄粉喂养斑马鱼移除微孔板中的培养液，设置多个实验组若干个不同浓度的鸡蛋黄粉喂食组和I个空白对照组，每个实验组根据微孔板的规格分别加入相同体积的相应溶液，然后恒温培养。优选的，还包括以下几个步骤(3)斑马鱼组织化学染色或荧光染色；(4)图像分析和/或微孔板分析；(5)统计学分析。优选的，步骤(I)中挑选的斑马鱼为受精后6-7天的斑马鱼；优选的，步骤⑵中斑马鱼培养时间为72小时；优选的，空白对照组使用的溶液为斑马鱼养殖用水，此养殖用水溶解氧浓度为6-8mg/L、水温为 28°C、pH 为 7. 2-7. 6、总硬度为 200_250mg/L ；优选的，斑马鱼恒温培养的温度为28°C ；优选的，斑马鱼组织化学染色或荧光染色包括以下步骤1)固定，2)脱水，3)染色，4)脱色，5) PBST洗脱； 优选的，图像分析具体步骤为斑马鱼组织化学染色或活体斑马鱼荧光染色结束后，在显微镜下拍照并保存图片；一方面通过观察斑马鱼血液中脂肪染色强度来进行定性评价；另一方面利用软件对斑马鱼尾部血管进行图像分析，通过计算斑马鱼尾部血管的脂肪染色强度来进行定量评价；优选的，微孔板分析具体步骤为斑马鱼荧光染色后，将斑马鱼转入96孔板中，每孔I尾，然后将微孔板置于多功能微孔板分析仪下检测荧光强度；优选的，统计学分析步骤为统计学处理结果以X士SE表示，多组间比较采用单因子方差分析，两组间比较采用Dunnett’ s T-检验进行统计学处理，p < O. 05为差异性显著。优选的，斑马鱼组织化学染色或荧光染色具体步骤如下I)固定移除微孔板中的鸡蛋黄粉培养液，加入4%多聚甲醛(PFA)对斑马鱼进行固本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种斑马鱼高脂血症模型的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)斑马鱼选取挑取发育正常的斑马鱼放入微孔板中；(2)用鸡蛋黄粉喂养斑马鱼移除微孔板中的培养液，设置多个实验组：若干个不同浓度的鸡蛋黄粉喂食组和1个空白对照组，每个实验组根据微孔板的规格分别加入相同体积的相应溶液，然后恒温培养。

【技术特征摘要】
1.一种斑马鱼高脂血症模型的建立方法，其特征在于，包括以下步骤 (1)斑马鱼选取 挑取发育正常的斑马鱼放入微孔板中； (2)用鸡蛋黄粉喂养斑马鱼 移除微孔板中的培养液，设置多个实验组若干个不同浓度的鸡蛋黄粉喂食组和I个空白对照组，每个实验组根据微孔板的规格分别加入相同体积的相应溶液，然后恒温培养。2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，还包括以下几个步骤 (3)斑马鱼组织化学染色或荧光染色； (4)图像分析和/或微孔板分析； (5)统计学分析。3.如权利要求I或2所述的建立方法，其特征在于优选的，步骤(I)中挑选的斑马鱼为受精后4-7天的斑马鱼； 优选的，步骤(2)中斑马鱼培养时间为72小时； 优选的，空白对照组使用的溶液为斑马鱼养殖用水，此养殖用水溶解氧浓度为6-8mg/L、水温为 28°C、pH 为 7. 2-7. 6、总硬度为 200_250mg/L ； 优选的，斑马鱼恒温培养的温度为28°C。4.如权利要求2或3所述的建立方法，其特征在于 优选的，斑马鱼组织化学染色或荧光染色包括以下步骤1)固定，2)脱水，3)染色，4)脱色，5) PBST洗脱； 优选的，图像分析具体步骤为斑马鱼组织化学染色或活体斑马鱼荧光染色结束后，在显微镜下拍照并保存图片；一方面通过观察斑马鱼血液中脂肪染色强度来进行定性评价；另一方面利用软件对斑马鱼尾部血管进行图像分析，通过计算斑马鱼尾部血管的脂肪染色强度来进行定量评价； 优选的，微孔板分析具体步骤为活体斑马鱼荧光染色后，将斑马鱼转入96孔板中，每孔I尾，然后将微孔板置于多功能微孔板分析仪下检测荧光强度； 优选的，统计学分析步骤为统计学处理结果以J 表示，多组间比较采用单因子方差分析，两组间比较采用Dunnett’ s T-检验进行统计学处理，p < O. 05为差异性显著。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于斑马鱼组织化学染色或荧光染色具体步骤如下 1)固定 移除微孔板中的鸡蛋黄粉培养液，加入4%多聚甲醛(PFA)对斑马鱼进行固定，需室温固定4小时(h)以上或者4°C固定过夜； 2)脱水 ①室温下，在IOml的75%PBS/25%丙二醇，脱水10分钟； ②室温下，在IOml的50%PBS/50%丙二醇，脱水10分钟； ③室温下，在IOml的25%PBS/75%丙二醇，脱水10分钟； ④室温下，在IOml的100%丙二醇，脱水10分钟；3)染色 A :组织化学染色用1%油红O染色液进行染色,28°C过夜； B :荧光染色用10ng/mL尼罗红染色液进行染色，28°C过夜； 4)脱色 ①室温下，在IOml的100%丙二醇，脱色10分钟； ②室温下，在IOml的25%PBS/75%丙二醇，脱色10分钟； ③室温下，在IOml的50%PBS/50%丙二醇，脱色10分钟； ④室温下，在IOml的75%PBS/25%丙二醇，脱色10分钟 ⑤室温下，在IOml的100%PBS，脱色10分钟； 5)PBST洗脱...

【专利技术属性】
技术研发人员：李春启，陈汝家，郭胜亚，张勇，
申请(专利权)人：杭州环特生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：