本发明专利技术涉及一种细菌感染模型的构建方法，并利用该动物模型进行细菌感染研究以及筛选抗生素。模型的构建方法主要包括：斑马鱼选取，细菌注射，图像分析和/或微孔板分析，统计学分析几个步骤。本发明专利技术的方法具有简便、快速、经济、高效、高通量等优点，本模型可用于细菌感染研究以及筛选抗生素。本发明专利技术对加快降抗生素的研发及改善细菌感染患者的治疗具有意义重大。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物模型构建领域，具体涉及一种斑马鱼细菌感染模型的构建方法及其应用。
技术介绍
细菌产生耐药性是人类在病菌控制和治疗中碰到的一个棘手问题，对抗生素产生耐药性的细菌正在成为日益严重的威胁，并且变得越来越普遍。而抗生素的过度使用导致细菌产生多重耐药性，从而使人类面临“超级细菌感染”的危险[I]。大肠杆菌是革兰氏阴性菌中最易产生耐药性的细菌，2011年5月在德国爆发的肠出血性大肠杆菌(EHEC)疫情就是由一种名为“huSec41”的肠出血性大肠杆菌(EHEC)变种引起的，这一变种对很多抗生素具有耐药性。抗生素在畜牧业中的滥用也导致多种动物源大肠杆菌具有了一定抗生素耐 药性[2]，这使得畜牧业的稳定和健康发展时刻面临巨大的威胁。要解决具有多重耐药性的超级细菌对人类健康和畜牧业发展的威胁，除了加强对抗生素使用的规范管理，减少抗生素的滥用外，最根本的办法还是要加快抗生素的研发速度，开发出新的、更为有效的抗生素。只有不断采用新的研究技术和工艺，才能加快抗生素的研发速度。虽然体外细胞实验可以很好地阐明病菌和宿主之间相互作用的关键步骤，但是无法获得与整体动物相关的一些重要信息。随着生物学技术的进步和动物替代模型的出现，曾经阻碍用活体动物进行病菌毒性研究的技术障碍和伦理问题都已经得到了很好地解决。常用的较为低等的病菌感染替代动物模型包括果蝇[3]、线虫[4，5]和阿米巴虫[6]等一些发育生物学研究已经很广泛的动物，对这些低等动物发育生物学的深入研究已经为医药学家提供了大量的实验工具和实验材料。但是，果蝇和线虫等低等动物与人类的生物等级差别太大，基因相似度低，生理结构和生理功能有较大差别，因此，其药物实验结果的预测可靠性与可比性较差。所以，迫切需要开发新的较为低等的动物模型，以便既能替代大小鼠等高等动物，又能保证实验结果的预测可靠性与可比性较高。斑马鱼是一种硬骨鱼，属于脊椎动物，与果蝇、线虫和阿米巴虫等低等相比，斑马鱼与人类的基因相似度更高(85%以上)、生理结构和生理功能更为接近；与鼠类等哺乳动物相比，斑马鱼胚胎透明，可同时观察分析多个器官，实验周期短，样本容量大，结果可信度高，所需费用低[7]。此外，斑马鱼有着与哺乳动物非常相似的发育良好的免疫系统(包括先天性免疫和获得性免疫)[8，9]。这些优点使得斑马鱼成为了研究病菌感染机制和筛选抗生素的一种非常有用的动物模型。
技术实现思路
为了克服上述现有技术的缺陷和不足，专利技术人经研究，旨在提供一种简单、快速、经济、高通量的斑马鱼细菌感染模型的构建方法及其应用。本专利技术是通过以下技术方案实现的I. 一种斑马鱼细菌感染模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤(I)斑马鱼选取挑取发育正常的斑马鱼放入微孔板中；(2)细菌注射设置若干个细菌注射组、I个溶剂注射组、I个空白对照组，将带有荧光标记的细菌用灭菌的IXPBS缓冲液洗脱3次，然后用显微注射的方式将细菌注入斑马鱼体内，注射结束后，洗脱除去残留的麻醉剂，并将斑马鱼转入6孔板中，每孔中加入等体积的养殖用水，作为细菌注射组；溶剂注射组注射等体积灭菌的IXPBS缓冲液；空白对照组注射等体积的养殖用水；恒温培养。优选的，还包括以下步骤(3)图像分析和/或微孔板分析；(4)统计学分析。 优选的，步骤⑴中挑选的斑马鱼为受精后2天的斑马鱼；优选的，步骤(2)中每个斑马鱼细菌注射量为3000-3500CFU ；优选的，步骤(2)中的注射方式为心包注射或卵黄囊注射；优选的，步骤⑵中细菌为大肠杆菌；优选的，所述养殖用水其溶解氧浓度为6-8mg/L、水温为28°C、pH为7. 2-7. 6、总硬度为 200-250mg/L ；优选的，步骤⑵中斑马鱼恒温培养的温度为34°C ；优选的，步骤(2)中斑马鱼恒温培养的时间为72h。优选的，图像分析具体步骤为移除微孔板中的液体，加入等体积浓度为O. 64mM的甲磺酸将斑马鱼麻醉处死后，用3%甲基纤维素胶将斑马鱼固定于双凹载玻片上后，置于荧光显微镜下观察各实验组斑马鱼体内的细菌生长情况并拍照保存，用ImageJ图像分析软件或尼康NIS-Elements D3. 10高级图像处理软件对图像进行分析,计算斑马鱼体内的细菌相对荧光强度；优选的，微孔板分析具体步骤为将斑马鱼转入96孔板，每孔I尾。然后将微孔板置于多功能微孔板分析仪下检测荧光强度；优选的，统计学分析步骤为统计学处理结果以土SE表示，多组间比较采用单因子方差分析，两组间比较采用Dunnett’ s T-检验进行统计学处理，p < O. 05为差异性显著。2.前述的构建方法得到的斑马鱼细菌感染模型用于细菌感染研究的用途。3.前述的构建方法得到的斑马鱼细菌感染模型用于评价或筛选抗生素的用途。优选的，还包括以下步骤(3)化合物处理移除微孔板中的养殖用水，设置多个实验组若干个化合物处理组，I个模型组，I个阳性对照组，化合物处理组中加入相同体积、浓度分别为O. I μ M、I μ M、10 μ M、100 μ M和200 μ M的化合物；模型组加入等体积的养殖用水；于34°C恒温培养箱中培养；(4)图像分析和/或微孔板分析；(5)统计学分析。优选的，步骤(3)阳性对照组加入的溶液为氨苄西林；优选的，图像分析具体步骤为移除微孔板中的液体，加入等体积浓度为O. 64mM的甲磺酸将斑马鱼麻醉处死后，用3%甲基纤维素胶将斑马鱼固定于双凹载玻片上后，置于荧光显微镜下观察各实验组斑马鱼体内的细菌生长情况并拍照保存，用ImageJ图像分析软件或尼康NIS-Elements D3. 10高级图像处理软件对图像进行分析,计算斑马鱼体内的细菌相对荧光强度；优选的，微孔板分析具体步骤为将斑马鱼转入96孔板，每孔I尾。然后将微孔板置于多功能微孔板分析仪下检测荧光强度；优选的，统计学分析步骤为统计学处理结果以土SE表示，多组间比较采用单因子方差分析，两组间比较采用Dunnett’ s T-检验进行统计学处理，p < O. 05为差异性显著。优选的，化合物处理后的斑马鱼培养时间为48小时。优选的，所述的化合物为卡那霉素、庆大霉素、氯霉素或链霉素。本专利技术提供了一种斑马鱼细菌感染模型的构建方法及其应用，该方法具有简便、快速、成功率高、重复性好且稳定可靠等优点，能实现定性分析与定量分析。将用荧光标记的细菌注射到斑马鱼体内之后，只要在荧光显微镜下观察斑马鱼体内的荧光强度就可以斑马鱼体内的细菌数量进行定性分析；在荧光显微镜下拍照并利用图像分析软件对斑马鱼体内的细菌数量进行定量分析；也可以用荧光酶标仪对斑马鱼体内的细菌数量进行高通量的定量分析。具体地说，本专利技术具有如下优点I)活体内——实验材料为活体斑马鱼，作为一种脊椎动物，其筛选模型属体内模型，能够真实反映药物在体内的吸收、分布、代谢与排泄，真正反映药物的整体生物活性。2)高通量——斑马鱼幼鱼很小，只有1-4毫米，能够在一个标准的6，12，24，48，96或384孔板内进行分析和实验周期短使斑马鱼成为一种能进行高通量自动化体内药物筛选的理想模型。3)经济一所需费用低，以猴子为实验载体的筛选实验每只每天耗费大于10美元，以老鼠为实验载体的筛选实验每只每天耗费大于I美元，而以斑马鱼为实验载体的筛选实验每只每天耗费小于0.01美元。本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种斑马鱼细菌感染模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)斑马鱼选取挑取发育正常的斑马鱼放入微孔板中；(2)细菌注射设置若干个细菌注射组、1个溶剂注射组、1个空白对照组，将带有荧光标记的细菌用灭菌的1×PBS缓冲液洗脱3次，然后用显微注射的方式将细菌注入斑马鱼体内，注射结束后，洗脱除去残留的麻醉剂，并将斑马鱼转入6孔板中，每孔中加入等体积的养殖用水，作为细菌注射组；溶剂注射组注射等体积灭菌的1×PBS缓冲液；空白对照组注射等体积的养殖用水；恒温培养。
【技术特征摘要】
1.一种斑马鱼细菌感染模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤 (1)斑马鱼选取 挑取发育正常的斑马鱼放入微孔板中； (2)细菌注射 设置若干个细菌注射组、I个溶剂注射组、I个空白对照组，将带有荧光标记的细菌用灭菌的IXPBS缓冲液洗脱3次，然后用显微注射的方式将细菌注入斑马鱼体内，注射结束后，洗脱除去残留的麻醉剂，并将斑马鱼转入6孔板中，每孔中加入等体积的养殖用水，作为细菌注射组；溶剂注射组注射等体积灭菌的IXPBS缓冲液；空白对照组注射等体积的养殖用水；恒温培养。2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，还包括以下步骤 (3)图像分析和/或微孔板分析； (4)统计学分析。3.如权利要求I或2所述的建立方法，其特征在于优选的，步骤(I)中挑选的斑马鱼为受精后2天的斑马鱼； 优选的，步骤(2)中每个斑马鱼细菌注射量为3000-3500CFU ； 优选的，步骤(2)中的注射方式为心包注射或卵黄囊注射； 优选的，步骤(2)中细菌为大肠杆菌； 优选的，所述养殖用水其溶解氧浓度为6-8mg/L、水温为28°C、pH为7. 2-7. 6、总硬度为200_250mg/L ； 优选的，步骤(2)中斑马鱼恒温培养的温度为34°C ； 优选的，步骤(2)中斑马鱼恒温培养的时间为72h。4.如权利要求2或3所述的构建方法，其特征在于 优选的，图像分析具体步骤为移除微孔板中的液体，加入等体积浓度为O. 64mM的甲磺酸将斑马鱼麻醉处死后，用3%甲基纤维素胶将斑马鱼固定于双凹载玻片上后，置于荧光显微镜下观察各实验组斑马鱼体内的细菌生长情况并拍照保存，用ImageJ图像分析软件或尼康NIS-Elements D3. 10高级图像处理软件对图像进行分析,计算斑马鱼体内的细菌相对荧光强度； 优选的，微孔板分析具体步骤为将斑马鱼转入96孔板，每孔I尾。然后将微孔板置于多功能微孔板分析仪下检测荧光强度； 优选的，统...
【专利技术属性】
技术研发人员：李春启，张勇，劳乔聪，朱凤，郭胜亚，
申请(专利权)人：杭州环特生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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