本发明专利技术涉及一种活体斑马鱼P-糖蛋白抑制剂筛选模型的建立以及评价或筛选P-糖蛋白抑制剂的方法，主要包括：斑马鱼选取，化合物处理，图像分析和/或微孔板分析几个步骤。本发明专利技术的方法具有经济、简便、快速、高效、化合物用量少等优点。本发明专利技术能显著提高P-糖蛋白抑制剂评价或筛选的速度，对加快大规模P-糖蛋白抑制剂的筛选和评价具有重要意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于药物筛选(评价)领域，具体涉及一种简单、经济、高通量的斑马鱼 P-糖蛋白抑制剂筛选模型的建立方法以及利用该动物模型筛选与评价P-糖蛋白抑制剂的方法。
技术介绍
恶性肿瘤是严重危害人类健康的常见疾病。据世界卫生组织(WHO)报道，目前全世界每年新发现癌症患者约1000万，死于癌症的人数600 700万，而在中国近20年来的癌症死亡率上升了近30% 。化疗是治疗癌症的重要手段，但化疗中常见且难以解决的问题是肿瘤多药耐药性 (Multidrug resistance，MDR)的产生，即肿瘤细胞在化疗药物或其他因素的作用下，对多种化学结构相似或不同的抗癌药物产生耐药性。MDR形成的最主要的分子机制是肿瘤细胞多药耐药基因MDRl高表达，MDRl基因是ABC基因家族的一个亚族，其编码产物为P-糖蛋白(P-glycoprotein，Pgp)。Pgp为跨膜糖蛋白，分子量为170 180KD，Pgp能够与进入细胞浆的抗肿瘤药物结合，借助ATP水解释放出的能量，直接或间接将药物泵出细胞；或借 Pgp本身的通道作用，将药物从细胞内泵出细胞外，导致肿瘤细胞内药物浓度降低、细胞毒性或靶向治疗作用减弱或丧失，进而使肿瘤细胞产生耐药性 ]。因此，使用Pgp抑制剂是逆转MDR的一个重要手段。近年来，评价与筛选Pgp抑制剂已成为抗肿瘤药物研究的前沿热点之一。建立Pgp抑制剂筛选模型对于评价与筛选Pgp抑制剂至关重要。目前Pgp抑制剂筛选模型主要有两大类，一类是体外细胞模型，另一类是体内耐药动物模型。体外细胞模型研究是利用肿瘤耐药细胞株来揭示肿瘤细胞的耐药机制、研究肿瘤细胞的耐药性逆转、开发及评价新的抗癌方法等。该模型研究方法虽然简单、所需费用较低，但体外细胞缺少药物在生物整体内的代谢转化和体内的循环分布，不能反映药物在体内的真实情况，对Pgp 抑制剂的实际疗效预测性差。体内耐药动物模型的建立主要通过原位移植、皮下移植_ 和腹腔移植三种途径。通常认为原位移植优于皮下移植，主要是由于能够模拟体内的器官微环境，虽能更好的反映肿瘤的形态特点和生物学行为，但由于操作复杂，创伤性大，每次接种数量有限，肿瘤深在不利于观察和治疗的部位，应用受到一定程度的限制；皮下移植法尽管操作简单，易于观察，但肿瘤生长局限，几乎无转移；腹腔移植法由于位置深，难以观察，潜伏期长且肿瘤生长慢。因此建立一种既能很好地模拟药物在体内的吸收、分布、代谢和排泄过程，又能快速、准确的评价与筛选地Pgp抑制剂的动物模型具有重要意义。斑马鱼是一种新颖的模式生物。与传统的体内和体外筛选模型相比较，活体斑马鱼筛选模型具有诸多优势，克服了原有体外模型在吸收、分布、代谢和排泄环节验证的欠缺及传统体内筛选模型实验周期长、操作复杂、成本高的弊端。斑马鱼是一种脊椎动物，与人类基因的相似度高达85%以上，实验结果可比性强。与鼠类等哺乳动物相比，斑马鱼胚胎透明，可同时观察分析多个器官，实验周期短，样本容量大，结果可信度高，所需费用低。更重要的是，斑马鱼模型具有与生俱来的优点①饲养成本低，性成熟周期短；②繁殖能力强，一尾雌鱼每次可产200 300枚卵；③生长发育速度快，在受精后M小时04hpf)， 斑马鱼主要的组织器官原基已形成，可为研究提供大量的样本和较短的实验周期；④胚胎及幼鱼透明，体外受精，体外发育，可直接观察，并可同时分析多个器官系统；⑤胚胎有可以提供营养的卵黄，第一周内不需喂食，可避免化合物处理时化合物与食物成份的相互作用；⑥胚胎体积小，幼鱼体长只有l_4mm，能够在一个标准的6、12、24、48或96孔板内进行分析；⑦给药方式简单溶于水的小分子物质可直接经皮肤、鳃及消化系统进入斑马鱼体内；不溶于水的物质、大分子物质及蛋白质可进行显微注射。因此斑马鱼可作为很好的疾病模型研究材料。系统发育学研究证实斑马鱼具有52个ABC转运基因，包括人类所有的48个ABC转运基因，斑马鱼ABC基因与人类ABC基因的同源性高达77%，两者具有一一对应的关系。目前ABC基因(特别是ABCC1/MRP1，即MDRl基因)已被广泛研究，斑马鱼ABCCl/ MRPl基因位于第3条染色体上，并且含有一个长度为4，557bp的开放阅读框，该基因编码的多肽由1，518个氨基酸组成，与人类ABCCl基因的同源性达到70%。斑马鱼在Ihpf时， ABCCl基因呈高度表达；Ihpf至12hpf发育阶段，ABCCl基因广泛分布于整个胚胎；24hpf至 72hpf发育阶段，主要分布于眼睛和脑部。目前国内外还未见有利用整体斑马鱼模型筛选Pgp抑制剂的报道，有少数研究也只是探讨化合物(毒物)对斑马鱼Pgp的毒性机理或针对MDR基因进行遗传学分析。 国际公开号为WO 2005/080974(01. 09. 2005 Gazette 2005/35)的专利研究发现，通过对斑马鱼血脑屏障中Pgp机制的抑制作用可筛选中枢神经系统治疗药。与该专利不同的是，本专利技术利用整体斑马鱼模型评价与筛选Pgp抑制剂。环孢菌素A是一种从真菌属中提取的天然药物，它能竞争性地与Pgp结合，阻断Pgp泵出药物功能从而逆转MDR。脂质体荧光染料罗丹明B已被证实为一种Pgp特异性底物。本专利技术选用罗丹明B为Pgp的底物，环孢菌素A为建立Pgp模型的阳性对照药物。由于多药耐药性机制的存在，正常斑马鱼将罗丹明B泵出体外，从而存留在体内的荧光染料很少，荧光强度很弱；而用环孢菌素A处理后， Pgp的活性受到抑制，Pgp底物罗丹明B不能被排出，从而存留在斑马鱼体内的罗丹明B增多，荧光强度增强。推广开来，若某种化合物能够增加罗丹明B在斑马鱼体内的存留，则该种化合物可作为潜在的Pgp抑制剂(见附图说明图1)。经广泛的实验条件优化，本专利技术选用4hpf阶段的斑马鱼作为实验材料，药物处理时间长度为Mh (即斑马鱼发育至2 !pf时)。
技术实现思路
为了克服上述现有技术存在的缺陷和不足，专利技术人经过研究，旨在提供一种简单、 经济、高通量的斑马鱼P-糖蛋白抑制剂筛选模型的建立方法以及利用该动物模型筛选与评价P-糖蛋白抑制剂的方法。本专利技术是通过以下技术方案来实现的一种活体斑马鱼P-糖蛋白抑制剂筛选模型的建立方法，其特征在于，包括以下步骤(1)斑马鱼选取挑取发育正常的斑马鱼放入微孔板中；5(2)化合物处理移除微孔板中的培养液，设置多个实验组，每个实验组包括1个罗丹明B处理组、1 个Pgp抑制阳性对照组和1个空白对照组，每个实验组根据微孔板的规格分别加入相应的溶液，然后恒温培养；(3)图像分析和/或微孔板分析。优选的，所述的罗丹明B处理组中 加入的溶液为罗丹明B溶液，所述的Pgp抑制阳性对照组中加入的溶液为与罗丹明B处理组等体积的罗丹明B与环孢菌素A的混合溶液， 混合溶液中罗丹明B的浓度与罗丹明B处理组中相同，环孢菌素A的浓度为10mM。优选的，所述的步骤(1)中斑马鱼为4hpf的斑马鱼。优选的，所述步骤(2)化合物处理中斑马鱼培养M小时。优选的，所述的步骤( 化合物处理中斑马鱼于下恒温培养。优选的，空白对照组中使用的溶液为斑马鱼养殖用水。优选的，所述步骤(3)图像分析步骤如下处理一段时间后，每组随机选取若干尾斑马鱼，利用立体荧光显微镜侧位拍照并保存，一方面通过观察对比各实验组斑马鱼荧本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种活体斑马鱼Ｐ－糖蛋白抑制剂筛选模型的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：（１）斑马鱼选取挑取发育正常的斑马鱼放入微孔板中；（２）化合物处理移除微孔板中的培养液，设置多个实验组，每个实验组包括１个罗丹明Ｂ处理组、１个Ｐｇｐ抑制阳性对照组和１个空白对照组，每个实验组根据微孔板的规格分别加入相应的溶液，然后恒温培养；（３）图像分析和／或微孔板分析。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：朱晓宇，李春启，郭胜亚，
申请(专利权)人：杭州环特生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：86
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