一种用模式生物斑马鱼研究药物代谢的新方法技术

本发明专利技术公开了一种用模式生物斑马鱼研究药物代谢的新方法，该方法通过选用斑马鱼作为药物代谢研究的对象，通过优化的实验分组方法进行实验分组设计，采用优选的药物给药方式进行给药，并采用优选的方法提取经斑马鱼代谢后的药物代谢物，并采用优选的分析方法对代谢物进行分析，整个实验方法可操作性强，能客观的反应药物在体内的真实代谢情况，实验结果准确度高，能克服一般体外代谢实验难以体现在体代谢综合结果的缺点和一般体内代谢实验所用药量大、劳动强度高的缺点，实验方法可重复性强，所需受试药物量少，成本低，劳动强度低，应用范围广泛，且可成批量进行实验研究，工作效率高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种药物代谢研究方法，具体涉及一种用模式生物斑马鱼快速研究药 物代谢的新方法。
技术介绍
药物代谢是研究药物在机体作用下发生的化学结构转化特点和规律的一门科学。 结构变化包括氧化、还原、分解、结合等方式。经过代谢，其药理作用被减弱和消失。药物代 谢研究对药动学、药效学、毒理学及其他生物医学学科发展有重大影响。药物代谢研究方法常包括体内实验法和体外实验法，体内实验法动物给药后，在 一定时间内将动物处死，取消化道各部分内容物进行分析，并检查血液、尿、粪便、胆汁，检 测代谢物的结构变化，研究药物的代谢转化，并推断其在消化道内的代谢过程。体内代谢试 验能客观的反应药物在体内的转化，但一般药物用量较大，不利于少量药物的快速代谢研 究；有些体内成分含量低微，即使采用现代分析手段有时也难以满足体内复杂体系的检测 需求，而加大药量或进一步富集、纯化样本等手段对结果的改善也是有限的；体内代谢劳动 强度相对较大，常需多人合作完成。体外实验法体外肝细胞代谢和胃肠道菌群代谢。肝细 胞代谢取肝勻浆、肝细胞微粒体或细胞色素P450酶与药物共孵育，检查原型成分及其代 谢物的种类和含量，是研究肝脏对药物代谢的有效体外方法。胃肠道菌群代谢粪便温孵法 和离体消化道内容物温孵法是研究药物在消化道内代谢的方法。许多药物成分是在消化道 菌丛作用下代谢的，特别是肠道内细菌的苷键水解酶或人的粪便孵液与药物在厌氧条件下 温孵，检查原型成分及其代谢物的种类和含量，是研究肠内菌对药物代谢的有效方法。体外 实验法虽然较有效的模拟了药物在体内代谢的不同环节，有益于富增、制备代谢产物，但脱 离了完整的代谢体系对药物的作用，难以体现在体代谢的综合结果；体外实验条件要求相 对较高，一般实验室难以进行。因此，建立一种既能体现在体代谢的综合效应，又能实现条 件简单，低劳动强度，化合物用量少的高通量代谢研究方法具有重要意义。斑马鱼是一种极好的模式生物，是取代青蛙、果蝇、小白鼠等作为研究对象的优良 试验模式鱼。斑马鱼喂养和维持的费用更便宜，所需空间场地不大，易于室内大规模繁殖。 成体鱼长3 4cm，养殖成本仅为养小鼠的0. 1%-1%。斑马鱼同人类基因的相似度与小鼠 相当，且在蛋白质水平上，其关键部位的同源性几乎是100%，所以可用斑马鱼模拟人类疾 病[P. Goldsmith, Curr Opin Pharmacol，4，504-12 (2004)]。目前，人们已成功的用斑马鱼 建立许多人类疾病模型，如神经系统、循环系统、听觉、视觉、癌症等方面的疾病[S. Sumanas and S. Lin, DDT :TARGETS，3，89-96 (2004).]。如中国专利 200810019040. 5 公开了一种用 斑马鱼研究药物毒性的方法，专利200780051025. 2公开了一种通过干细胞营养进行的器 官的形成和以及酒精损伤器官的再生方法，200310108710. 8公开了利用斑马鱼基因治疗 截瘫等疾病。并且斑马鱼具有药物代谢的P450s相关酶系目前已克隆到的斑马鱼P450s 基因主要包括CyplA、Cyp2K6、Cyp3a65 和 Cyp3Cl、CyplIal、Cyp 19, Cyp26Al、Cyp26Bl 和 Cyp26Dl几个家族的成员，它们与人类相应基因的同源性约为40% 73% [P. Collodi,C. L. Miranda, X. Zhao, D. R. Buhler, D. W. Barnes. Xenobiotica, 24 (6)，487-493 (1994) ]。 ■ 马鱼具有完整的代谢器官系统和代谢酶系，以及与哺乳动物相似的系统及基因，为研究人 类许多常见疾病的发病机制提供了理想的实验模型，同时也为药物的作用机制、安全性评 价及代谢研究提供了理想的实验模型。因此可将它作为具有完整代谢体系的理想模式生物 用于药物的代谢研究。国内在这方面的研究尚属空白。
技术实现思路
专利技术目的本专利技术所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种操作方 便、成本低、化合物用量少、劳动强度低，且仅需在一般实验室就可进行的快速模式生物斑 马鱼研究药物代谢的新方法。技术方案为了实现以上目的，本专利技术采取的技术方案为，它包括以下步骤(1)取斑马鱼的成体鱼放入盛有水的容器里，分为空白溶液组，空白鱼组、空白药 物组和药物鱼组，空白溶液组和药物鱼组斑马鱼数量相等，将受试药物配成所需浓度，加入 到药物鱼组的水溶液中，空白对照组加入等量的溶媒，空白鱼组只加等量溶媒不放斑马鱼、 空白药物组加溶媒溶解的等量药物不放斑马鱼，在药物鱼组的斑马鱼暴露于药液后Oh 24h内不同时间点将鱼取出，用纯净水迅速洗涤2 3次，处死，去除鱼鳍和鱼磷，称重， 于-70°C冰箱放置，并取各时间点鱼药液，于-70°C冰箱放置，空白溶液组，空白鱼组和空白 药物组于Oh和24h时同法取样，备用；(2)取步骤⑴得到的各时间点鱼药液冷冻干燥，残渣加适量溶剂溶解，过 0. 45 μ m或0. 22 μ m滤膜或15000转/min离心，取滤液或上清液进行高效液相色谱HPLC分 析或高效液相色谱与质谱联用LC-MS分析；取各时间点斑马鱼鱼体剪碎，称重，勻浆，勻浆 液加甲醇或乙腈除蛋白，或勻浆液离心后直接用溶剂萃取药物成分，离心取上清或合并萃 取液，过0. 45 μ m或0. 22 μ m滤膜或约15000转/min离心，滤液或上清液进行HPLC分析或 LC-MS分析。作为优选方案，以上所述的用模式生物斑马鱼研究药物代谢的新方法，其中步骤 (1)中的空白溶液组，空白鱼组、空白药物组和药物鱼组均平行设3个组，保证实验的科学 性。作为优选方案，以上所述的用模式生物斑马鱼研究药物代谢的新方法，步骤(1) 中药物鱼组的斑马鱼暴露于药液后0h，lh, 2h，4h，6h，8h，12h，18h，24h时间点将鱼取出，取 鱼体，并在这些时间点取鱼药液。采用连续时间间隔点取样可以充分明确药物的代谢方式 和代谢特点，为指导药物的临床用药和药物剂型的选择提供科学依据。作为优选方案，其中步骤(1)所述的溶媒为水或者是含有0 二甲基亚砜助溶 剂的水溶液。对于水溶性较差的药物，采用二甲基亚砜助溶，可以有效提高药物的水溶性， 使药物均勻分散于水溶中。作为优选方案，以上所述的用模式生物斑马鱼研究药物代谢的新方法，步骤(2) 根据被分析药物的性质，根据相似相溶原则选择溶剂溶解或萃取受试药物，如药液残渣加 甲醇溶解，斑马鱼鱼体剪碎，称重，勻浆，勻浆液加甲醇或乙腈除蛋白，或勻浆液离心后直接 用溶剂萃取药物成分，离心取上清或合并萃取液，氮气吹干，残渣加溶剂溶解。本专利技术考察了将药液减压回收至干及直接冷冻干燥两种方法，结果表明将药液直 接冻干可最大限度的减少样品处理过程的损失及误差，实验结果更准确，因此步骤(2)将 各时间点鱼药液冷冻干燥，然后过滤或离心处理后上高效液相色谱HPLC分析或高效液相 色谱与质谱联用LC-MS分析。本专利技术所述的用模式生物斑马鱼研究药物代谢的新方法，作为优选方案，其中步 骤(2)采用Agilent 1100型系列高效液相色谱仪或采用灵敏度高的Waters Alliance 2695-ZQ 2000高效液相色谱-质本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用模式生物斑马鱼研究药物代谢的新方法，其特征在于，包括以下步骤：（１）取斑马鱼的成体鱼放入盛有水的容器里，分为空白溶液组，空白鱼组、空白药物组和药物鱼组，空白溶液组和药物鱼组斑马鱼数量相等，将受试药物配成所需浓度，加入到药物鱼组的水溶液中，空白对照组加入等量的溶媒，空白鱼组只加等量溶媒不放斑马鱼、空白药物组加溶媒溶解的等量药物不放斑马鱼，在药物鱼组的斑马鱼暴露于药液后０ｈ～２４ｈ内不同时间点将鱼取出，用纯净水迅速洗涤２～３次，处死，去除鱼鳍和鱼磷，称重，于－７０℃冰箱放置，并取各时间点鱼药液，于－７０℃冰箱放置，空白溶液组，空白鱼组和空白药物组于０ｈ和２４ｈ时同法取样，备用；（２）取步骤（１）得到的各时间点鱼药液冷冻干燥，残渣加适量溶剂溶解，过０．４５μｍ或０．２２μｍ滤膜或１５０００转／ｍｉｎ离心，取滤液或上清液进行高效液相色谱ＨＰＬＣ分析或高效液相色谱与质谱联用ＬＣ－ＭＳ分析；取各时间点斑马鱼鱼体剪碎，称重，匀浆，匀浆液加甲醇或乙腈除蛋白，或匀浆液离心后直接用溶剂萃取药物成分，离心取上清或合并萃取液，氮气吹干，残渣加溶剂溶解，过０．４５μｍ或０．２２μｍ滤膜或约１５０００转／ｍｉｎ离心，滤液或上清液进行ＨＰＬＣ分析或ＬＣ－ＭＳ分析。...

【技术特征摘要】
一种用模式生物斑马鱼研究药物代谢的新方法，其特征在于，包括以下步骤(1)取斑马鱼的成体鱼放入盛有水的容器里，分为空白溶液组，空白鱼组、空白药物组和药物鱼组，空白溶液组和药物鱼组斑马鱼数量相等，将受试药物配成所需浓度，加入到药物鱼组的水溶液中，空白对照组加入等量的溶媒，空白鱼组只加等量溶媒不放斑马鱼、空白药物组加溶媒溶解的等量药物不放斑马鱼，在药物鱼组的斑马鱼暴露于药液后0h～24h内不同时间点将鱼取出，用纯净水迅速洗涤2～3次，处死，去除鱼鳍和鱼磷，称重，于 70℃冰箱放置，并取各时间点鱼药液，于 70℃冰箱放置，空白溶液组，空白鱼组和空白药物组于0h和24h时同法取样，备用；(2)取步骤(1)得到的各时间点鱼药液冷冻干燥，残渣加适量溶剂溶解，过0.45μm或0.22μm滤膜或15000转/min离心，取滤液或上清液进行高效液相色谱HPLC分析或高效液相色谱与质谱联用LC MS分析；取各时间点斑马鱼鱼体剪碎，称重，匀浆，匀浆液加甲醇或乙腈除蛋白，或匀浆液离心后直接用溶剂萃取药物成分，离心取上清或合并萃取液，氮气吹干，残渣加溶剂溶解，过0.45μm或0.22μm滤膜或约15000转/min离心，滤液或上清...

【专利技术属性】
技术研发人员：韦英杰，李萍，贾晓斌，彭蕴茹，齐炼文，陈君，闻晓东，
申请(专利权)人：江苏省中医药研究院，中国药科大学，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]