建立斑马鱼肠蠕动模型及筛选促胃肠动力药物的方法技术

本发明专利技术属于药物筛选领域，具体涉及一种斑马鱼肠蠕动模型的建立方法及筛选促胃肠动力药物的方法，包括（1）斑马鱼选取；（2）模型诱导及化合物处理；（3）荧光显微镜定量分析。本发明专利技术首次应用一种荧光染料尼罗红来研究胃肠道蠕动情况，这个新的研究方法是对现有研究模型的一大补充，因其可操作性、非侵入性、简单、快捷，此肠蠕动模型对于高通量筛选促胃肠动力化合物有重要价值。

【技术实现步骤摘要】
建立斑马鱼肠蠕动模型及筛选促胃肠动力药物的方法
本专利技术属于药物筛选（评价）领域，具体涉及一种简便、经济、快速、高效、高通量的斑马鱼肠蠕动模型的建立方法，并且利用该动物模型筛选促胃肠动力药物和评价药物对肠蠕动的促进作用。
技术介绍
胃肠动力障碍性疾病是临床常见病，日常医疗工作中，约50％患者因消化道症状就诊，其中30％-40％最终确诊为胃肠动力障碍，如胃食管反流病（GERD）、功能性消化不良(FD)、胃轻瘫、假性肠梗阻、肠易激综合征及慢性便秘等[[i]]。胃肠动力障碍包括胃肠收缩无力，节律紊乱和异常方向收缩。虽然这些疾病有功能性或者器质性的原因，但应用促胃肠动力药物来恢复或增加已减弱的胃肠运动功能是这类疾病治疗的主要措施[[ii]]。临床上常用的促胃肠动力药有四代。第一代如甲氧氯普胺,商品名为胃复安、灭吐灵,是具有胆碱能特征的多巴胺受体拮抗剂。甲氧氯普胺有较多的中枢性副反应,早期用于治疗上消化道动力障碍如功能性消化不良、胃轻瘫等,目前己经被二代,第三代及第四代促动力药所代替。但由于胃复安有注射剂,并有止吐作用,临床上目前多作为止吐药使用[[iii]]。第二代促动力药是多潘立酮,商品名为吗丁琳,为外周多巴胺受体阻滞剂[[iv]],临床应用广泛。第三代是西沙必利,是一种化学结构上取代了烷化苯丙咪哇的甲氢氯普胺，近年临床发现在西沙必利高敏患者中可出现Q-T间期延长或导致尖端扭转性室性心动过速[[v]]，对于其在临床进一步应用，还存在着很大的争议。第四代为莫沙必利，为非选择性5-HT4受体激动剂，是新型促胃肠动力药物，安全、有效，临床正在广泛使用[[vi]]。目前最新的胃肠动力药为替加色罗和伊托必利，分别为5-HT4受体部分激动剂和多巴胺受体阻滞剂[[vii]]，另一种促动力药为红霉素，具有胃动素样的促动力效应,在促胃肠动力方面是研究的热点[[viii]]，但由于其上腹痛、恶心、呕吐等不良反应明显，限制了其临床应用。现代社会生活节奏加快、饮食结构改变等诸因素导致我国胃肠动力低下发病人群日益增多，开发胃肠动力药物具有广阔的市场潜力。药物筛选是发现、开发药物过程中一个重要的环节，实验动物肠蠕动模型的建立对评价与筛选胃肠动力药物至关重要。胃肠内容物的蠕动是胃肠平滑肌细胞、肠神经系统（ENS）、外在神经系统、Cajal间质细胞、肠粘膜、内分泌激素系统一起综合作用的结果[[ix]]。由于其复杂性，胃肠蠕动模型面临许多挑战。体外细胞实验缺少组织器官结构，不能准确的模拟胃肠运动。大鼠、猪等离体器官，缺少周围神经反馈，也不能准确模拟胃肠运动[[x],[xi]]。哺乳动物实验利用影像技术来观察胃肠动力，费时费力且价格昂贵[[xii],[xiii]]。建立一种高通量、易操作的胃肠动力评价实验动物模型对新药研发和基础研究均十分迫切。斑马鱼是一种脊椎动物，与人类基因同源性高达85%，其信号传导通路与人类基本近似，生物结构和生理功能与哺乳动物高度相似，具有体积小（可用微孔板分析）、发育周期短、体外受精、透明（可直接用肉眼和解剖显微镜观察）、单次产卵数较高等特点[[xiv]]。斑马鱼模型既具有体外实验快速、高效、低廉、用药量小等优势，又具有哺乳类动物实验预测性强、可比度高、可观察多个器官等优点，近年已在化合物药效、毒性评价中得到广泛应用[[xv],[xvi]]。斑马鱼胃肠道在解剖学和细胞功能方面和人类相似，由内皮细胞、结缔组织、环状肌、外纵肌组成[[xvii]]。研究者已成功的用斑马鱼研究胃肠道生理功能[[xviii]]。尼罗红（9-二乙基氨基-5H-苯并[α]吩恶嗪-5-酮）是一种荧光染料,可以标记活体细胞培养中巨噬细胞、平滑肌细胞中的脂滴[[xix]]。因其无毒性，尼罗红染料在脂肪代谢疾病模型中广泛应用于活体染色[[xx]]。当斑马鱼卵暴露于尼罗红溶液中，富含脂肪的组织卵黄囊能被结合，在荧光显微镜下清晰的显示。当斑马鱼5-6天时，大部分卵黄囊被吸收,斑马鱼开始自发的胃肠蠕动摄食[[xxi]，[xxii]，[xxiii]]。因此，我们可以观察到肠道中尼罗红的充盈情况，而不被其它组织所干扰，并且其不被体内吸收[[xxiv]]。本专利技术首次应用一种荧光染料尼罗红，根据其在斑马鱼胃肠道蠕动情况来评价促胃肠动力药物药效。这个新的研究方法是对现有研究模型的一大补充，因其可操作性、非侵入性，此肠蠕动模型对于高通量筛选促胃肠动力化合物有重要价值。
技术实现思路
本专利技术的目的首先在于提供一种建立斑马鱼胃肠蠕动模型的方法，第二个目的提供一种应用斑马鱼胃肠蠕动模型筛选促胃肠动力药物的方法。本专利技术可以方便、快速、高效和高通量实现对促胃肠动力药物的定量评价。为实现本专利技术的目的，专利技术人提供如下技术方案：专利技术概述专利技术人首先提供了一种建立斑马鱼胃肠蠕动模型的方法，包括下述步骤：（1）斑马鱼选取选取受精后4-6天的正常发育的斑马鱼，放入微孔板中；（2）染料处理移除微孔板中的养殖用水，设置多个实验组：每个实验组根据微孔板的规格加入染料，然后恒温孵育2-24h。（3）移除染料移除微孔板中的染料，清洗三次后，加入养殖用水，接着将微孔板于恒温培养。（4）荧光显微镜定量分析；作为优选，根据本专利技术所述的一种建立斑马鱼肠蠕动模型的方法，其中，所述的步骤（1）中挑选的斑马鱼为受精后5天的斑马鱼。作为优选，根据本专利技术所述的一种建立斑马鱼肠蠕动模型的方法，其中，所述的养殖用水符合下述规格：溶解氧质量容量浓度为6-8mg/L、水温为28℃、pH为7.2-7.6、总硬度为200-250mg/L。作为优选，根据本专利技术所述的一种建立斑马鱼肠蠕动模型的方法，其中，所述的染料为尼罗红（Nilered），浓度为10ng/mL。作为优选，根据本专利技术所述的一种建立斑马鱼肠蠕动模型的方法，其中，所述的步骤（2）中斑马鱼培养时间为16小时。作为优选，根据本专利技术所述的一种建立斑马鱼肠蠕动模型的方法，其中，所述的荧光显微镜定量分析按照下述方法操作：移除微孔板中的液体，根据微孔板规格加入浓度为0.64mM的甲磺酸麻斑马鱼,用3%甲基纤维素胶侧位固定于双凹载玻片上后，接着置于荧光显微镜下对肠道部位进行拍照并保存，再利用图像处理软件进行图像分析，计算肠道荧光强度。促肠蠕动排空率计算公式如下：专利技术人还提供了一种建立斑马鱼肠蠕动模型筛选促胃肠动力药物的方法，包括下述步骤：（1）斑马鱼选取选取受精后4-6天的正常发育的斑马鱼，放入微孔板中；（2）染料处理移除微孔板中的养殖用水，设置多个实验组：每个实验组根据微孔板的规格加入染料，然后恒温孵育2-24h。（3）化合物处理移除微孔板中的荧光染液，然后按照待测化合物处理组、促肠蠕动阳性对照组、溶剂对照组、模型组，根据微孔板的规格分别加入相应的待测化合物溶液、促胃肠动力药物、溶剂、养殖用水，接着将微孔板于28℃下恒温培养6小时，其中，促胃肠动力药物为浓度为30µg/mL的吗丁啉溶液，溶剂为浓度为0.1%的二甲基亚砜。（4）荧光显微镜定量分析；作为优选，根据本专利技术所述的一种建立斑马鱼肠蠕动模型筛选促肠动力药物的方法，其中，所述的步骤（1）中挑选的斑马鱼为受精后5天的斑马鱼。作为优选，根据本专利技术所述的一种建立斑马鱼肠蠕动模型筛选促肠蠕动药物的方法，其中，所述的养殖用水符合下述规格本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种建立斑马鱼肠蠕动模型的方法，其特征在于，所述的方法包括下述步骤：（1）斑马鱼选取——选取发育正常的斑马鱼，放入微孔板中；（2）荧光染料处理——移除微孔板中的养殖用水，设置多个实验组：每个实验组根据微孔板的规格加入荧光染料，然后恒温孵育；（3）移除染料——移除微孔板中的荧光染料，清洗三次后，加入养殖用水，接着将微孔板于恒温培养；（4）荧光显微镜定量分析。

【技术特征摘要】
1.一种斑马鱼肠蠕动模型的建立方法，其特征在于，包括下述步骤：(1)斑马鱼选取选取受精后5天的正常发育斑马鱼，放入微孔板中；(2)荧光染料处理移除微孔板中的养殖用水，设置若干实验组，每个实验组均加入10ng/mL的尼罗红溶液，于28℃恒温孵育16h；(3)移除染料移除微孔板中的荧光染料，清洗三次后，加入养殖用水，接着将微孔板于28℃恒温培养；(4)荧光显微镜定量分析移除微孔板中的液体，加入浓度为0.64mM的甲磺酸麻醉斑马鱼，用3％甲基纤维素胶侧位固定于双凹载玻片上后，接着置于荧光显微镜下对肠道部位进行拍照并保存，再利用图像处理软件进行图像分析，计算肠道荧光强度，促肠蠕动排空率的计算公式如下：对计算结果进行统计学处理，根据统计学处理结果，判断已建立了斑马鱼肠蠕动模型。2.一种如权利要求1所述的建立方法得到的斑马鱼肠蠕动模型的用途，其特征在于，所述模型用于评价或筛选促胃肠动力药物。3.一种用如权利要求1所述的建立方法得到的斑马鱼肠蠕动模型评价或筛选促胃肠动力药物的方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：周娟，郭胜亚，李春启，
申请(专利权)人：杭州环特生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：