一种斑马鱼类过敏检测模型的建立及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种斑马鱼类过敏检测模型的建立方法，同时提供一种利用该模型评价注射剂（包括辅料）致敏性方法。模型的构建方法主要包括：确定类胰蛋白酶（Tryptase）检测底物BAPNA的反应浓度，确定斑马鱼的发育阶段，确定检测用斑马鱼数量，确定阳性对照化合物Compoud48/80的浓度，微孔板分析,统计学分析几个步骤。应用活体斑马鱼模型进行注射剂（包括辅料）的致敏性评价具有可靠、快速、高效、低廉、高性价比等优点，可实现体内高通量评价注射剂（包括辅料）的致敏性。本发明专利技术对注射剂（包括辅料）的安全性评价有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
一种斑马鱼类过敏检测模型的建立及其应用
本专利技术涉及一种体内检测模型，具体的说，涉及一种用于简单、快速和高效体内检测类过敏反应的斑马鱼模型构建方法及其应用。
技术介绍
许多临床所使用的药物既不是抗原也不是半抗原，这些药物进入人体内，不经过潜伏期，无抗原与抗体的结合过程，迅速发生与Ⅰ型变态反应相同的临床表现。由于这种反应只发生于极少数接受治疗剂量药物的个体，没有致敏过程，患者血清IgE浓度也未见升高，但表现为典型的速发性变态反应症状，因此Dukor[1]称之为假药物变态反应，或类过敏反应(anaphylactoidreactions)。迄今为止，关于类过敏反应的认识很多是从临床病例中得到的，由于临床应用的新药不断增多、临床中用药复杂化、不适当的药物混合等原因，类过敏反应有增多趋势。最新调查研究表明77%的急性过敏反应为类过敏反应，类过敏反应发生率远高于Ⅰ型变态反应。目前，对类过敏反应在过敏反应中的定位仍未明确，但研究者们趋向于认为它和Ⅰ型变态反应为急性过敏反应的两个亚类[2]。动物实验和体外实验研究在阐明类过敏反应的发生机制、建立检测类过敏反应的试验方法用于注射剂的安全性评价上具有重要意义，但是由于类过敏反应发病快、病情急、病程转归迅速，迄今未见有成熟的动物模型，体外试验的检测指标和方法也有待于进一步优化。因此，建立一种高效、快速的体内类过敏检测模型具有重要意义。斑马鱼是一种新颖的模式生物。与传统的体内和体外筛选模型相比较，活体斑马鱼筛选模型具有诸多优势，克服了原有体外模型在吸收、分布、代谢和排泄环节验证的欠缺及传统体内筛选模型实验周期长、操作复杂、成本高的弊端。斑马鱼是一种脊椎动物，与人类基因的相似度高达85%左右，实验结果可比性强。与鼠类等哺乳动物相比，斑马鱼胚胎透明，可同时观察分析多个器官，实验周期短，样本容量大，结果可信度高，所需费用低[3]。更重要的是，斑马鱼模型具有与生俱来的优点[3-4]：①饲养成本低，性成熟周期短；②繁殖能力强，一尾雌鱼每次可产200～300枚卵；③生长发育速度快，在受精24h后，斑马鱼主要的组织器官原基已形成，可为研究提供大量的样本和较短的实验周期；④胚胎及幼鱼透明，体外受精，体外发育，可直接观察，并可同时分析多个器官系统；⑤胚胎有可以提供营养的卵黄，第一周内不需喂食，可避免化合物处理时化合物与食物成份的相互作用；⑥胚胎体积小，幼鱼体长只有1-4mm，能够在一个标准的6、12、24、48或96孔板内进行分析；⑦给药方式简单：溶于水的小分子物质可直接经皮肤、鳃及消化系统进入斑马鱼体内；不溶于水的物质、大分子物质及蛋白质可进行显微注射。因此斑马鱼可作为很好的疾病模型研究材料。肥大细胞是类过敏反应的主要效应细胞，激活的肥大细胞数量与过敏程度相关，激活的肥大细胞越多，过敏程度越严重。类胰蛋白酶（Tryptase）是肥大细胞内预先合成的中性蛋白酶，是含量最多的介质，经肥大细胞脱颗粒释放到细胞外，其在肥大细胞中的储存和表达有高度的选择性，可作为肥大细胞的激活和脱颗粒的标志。Tryptase通常只少量地分泌到体液中，当过敏引起肥大细胞脱颗粒时大量进入体液。类胰蛋白酶的急性过敏反应阳性反应和阴性反应的预测准确率分别为92.6%和54.3%，而且Tryptase的半衰期为2小时，因此，Tryptase的表达水平常作为类过敏反应的检测标志物之一[5]。斑马鱼的肥大细胞，其结构与功能与哺乳类动物相似，参与机体的免疫反应和过敏反应[6]。N-苯甲酰-DL-精氨酸对硝基苯酰胺盐酸盐（BAPNA）是Tryptase特异性底物，可以检测斑马鱼体内的Tryptase表达水平[6]。检测某物质诱导斑马鱼体内24小时内的Tryptase表达水平，可以定量分析此物质的致敏性。本专利技术提供的斑马鱼类过敏检测模型的有利于高效、快速检测注射剂（包括辅料）的致敏性，对注射剂（包括辅料）的安全性评价有重要意义。与以往的模型相比，本专利技术具有如下优点：1）活体内—实验材料为活体斑马鱼，作为一种脊椎动物，其筛选模型属体内模型，能够真实反映药物在体内的吸收、分布、代谢与排泄，真正反映药物的整体生物活性。2）高通量—斑马鱼幼鱼很小，只有1-4毫米，能够在一个标准的6，12，24，48，96或384孔板内进行分析和实验周期短使斑马鱼成为一种能进行高通量自动化体内药物致敏性评价的理想模型。3）经济—所需费用低，以犬为实验载体的筛选实验每只每天耗费大于10美元，以豚鼠为实验载体的筛选实验每只每天耗费大于1美元，而以斑马鱼为实验载体的筛选实验每只每天耗费小于0.01美元。4）化合物用量少—检测化合物用量少，通常只需几毫克，而传统的筛选实验则需几毫克以上的化合物。5）简便—实验过程操作简单，斑马鱼经药物处理可进行定量分析此药物的致敏性，而传统动物实验操作过程复杂，判断指标主观，容易产生假阳性结果。6）快速—实验周期短，可在1天内完成；而豚鼠常需要数周到数月的时间，犬常需要数月至数年的时间。斑马鱼在第一个72小时以内完成胚胎发育。多数的内部器官，包括心血管系统、肠、肝脏和肾，在24-48小时内快速成型，传统的实验载体老鼠和猴子则分别需要21天和9个月方可完成胚胎发育。7）可靠的预测性—斑马鱼的基因与人类基因的相似度高达85%左右，其生物学功能与哺乳动物及人类高度相似，实验结果可比性强，预测性好。8）敏感性高—N-苯甲酰-DL-精氨酸对硝基苯酰胺盐酸盐（BAPNA）是Tryptase特异性底物，可以快速检测斑马鱼体内的Tryptase表达水平。9）稳定性高、重复性好—本专利技术重复实验十几次，所获实验结果基本相同。本专利技术应用价值应用活体斑马鱼模型进行注射剂（包括辅料）的致敏性评价具有可靠、快速、高效、低廉、高性价比等优点，可实现体内高通量评价注射剂（包括辅料）的致敏性。本专利技术对注射剂（包括辅料）的安全性评价有重要意义。试剂及仪器N-苯甲酰-DL-精氨酸对硝基苯酰胺盐酸盐（BAPNA）（911-77-3，阿拉丁）；Compound48/80（C48/80）（120M4040V，SIGMA）；Tween-80（#20080616，中国食品药品检定研究院包装材料与药用辅料检定所）；乳糖蛋白A和乳糖蛋白B（中国食品药品检定研究院包装材料与药用辅料检定所）；其他试剂均由北京鼎国昌盛科技有限公司提供。多功能微孔板分析仪（MithrasLB940，BertholdTechnologies）、96孔板（NestBiotech）。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种斑马鱼类过敏检测模型的建立方法，同时提供一种利用该模型评价注射剂（包括辅料）致敏性方法。本专利技术提供的方法具有简便、快速、经济、高效、高通量等优点。内容一：本专利技术提供一种斑马鱼类过敏检测模型的建立方法，设计方案为：1斑马鱼选取取4～5对斑马鱼亲本交配，按照Westerfield[7]的方法孵化胚胎。将处于最佳处理阶段的斑马鱼置于解剖显微镜下观察，挑取发育正常的斑马鱼移入96孔微孔板中。2斑马鱼类过敏检测模型建立条件的确定（1）Tryptase检测底物BAPNA的反应浓度的确定。（2）斑马鱼的发育阶段的确定。（3）检测用斑马鱼数量的确定。（4）阳性对照化合物Compoud48/80的浓度的确定。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种斑马鱼类过敏检测模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）Tryptase检测底物BAPNA的反应浓度的确定；（2）斑马鱼的发育阶段的确定；（3）检测用斑马鱼数量的确定；（4）阳性对照化合物Compoud48/80的浓度的确定。

【技术特征摘要】
1.一种斑马鱼类过敏检测模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)Tryptase检测底物BAPNA的反应浓度的确定，选择30mg/ml作为Tryptase检测底物BAPNA的最佳反应浓度；(2)斑马鱼的发育阶段的确定，选择受精后3天的斑马鱼作为最佳发育阶段；(3)检测用斑马鱼数量的确定，选择2尾作为最佳的斑马鱼数量；(4)阳性对照化合物Compoud48/80的浓度的确定，选择100μg/ml作为阳性对照化合物Compoud48/80的最佳浓度。2.如权利要求1所述的斑马鱼类过敏检测模型的构建方法，其特征在于，还包括以下步骤：(5)微孔板分析，将斑马鱼放入96孔板，然后将微孔板置于多功能微孔板分析仪下检测OD405的值。3.一种如权利要求1或2所述的斑马鱼类过敏检测模型的构建方法在评价溶解给药的注射剂致敏性中的应用。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，构建的斑马鱼类过敏检测模型按如下步骤评价溶解给药的注射剂致敏性：设置多个实验组：3个化合物处理组，1个模型组，1个溶剂组，1个阳性对照...

【专利技术属性】
技术研发人员：李春启，劳乔聪，俞航萍，
申请(专利权)人：杭州环特生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：