本发明专利技术涉及一种快速、定量评价化合物对斑马鱼血管生成促进作用的方法，该方法采用血管特异表达绿色荧光蛋白的转基因斑马鱼，通过直接在斑马鱼培养用水中加入待测药物，检测斑马鱼尾静脉网的相对面积，建立了一种快速、定量评价化合物对斑马鱼血管生成促进的方法，以用于药物筛选。在斑马鱼实验中，本发明专利技术首次将尾静脉网相对面积作为血管生成作用的评价新指标，分析待测物是否具有促进血管生成作用，更加科学、客观，提高了结果的准确性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及，具体 是一种通过检测血管特异表达绿色荧光的转基因斑马鱼的尾静脉网的相对面积来快速评 价外源性药物或环境异物对斑马鱼血管生成的促进作用的方法，属于药物筛选领域。
技术介绍
血管生成与多种疾病相关。血管生成不仅存在于胚胎发育时期，在整个生命周期 均有重要的生理、病理意义。在成人，其涉及肿瘤、炎症、缺血性疾病、糖尿病视网膜病、创伤 愈合等诸多病理过程而成为研究的重点。血管生成是连续、复杂的过程，是细胞-细胞（内皮 细胞、周细胞、平滑肌细胞、纤维细胞)之间，细胞和细胞因子之间在不同时空协同作用的结 果。 治疗性血管生成的概念，最早由Hockel于1993年提出，与传统的治疗手段(血管搭 桥)不同，它是利用成血管诱导因子或内皮祖细胞，模拟体内血管生成的机制，达到促血管 新生，改善侧支循环的目的，即通过刺激和诱导新生血管的形成来治疗和预防以局部缺血 为特征的临床各类疾病。实际上就是指以增加新生血管、改善血运为主要措施来治疗临床 上缺血性及其相关疾病的方法的总称。现已经广泛应用于缺血性及其相关疾病:心脏缺血、 肢体缺血、皮瓣愈合、周围神经损伤、伤口愈合等。 目前研究血管生成的动物模型主要有:大鼠模型、鸡胚尿囊膜模型和斑马鱼模型。 研究表明，斑马鱼与人类在血管发育过程中的基因、信号通路具有高度同源性，其结构、生 理、分子水平等方面与人类都很接近，而且与大鼠、鸡胚尿囊膜模型相比，斑马鱼具有成本 低、饲养条件要求低、个体小适合于高通量筛选、幼鱼身体透明易于观察血管发育的特点， 具有明显的优势，因此，采用斑马鱼进行血管生成的研究具有凸显的优势。 在斑马鱼评价血管生成促进作用的实验中，目前使用指标主要是节间血管、肠下 静脉，利用节间血管或肠下静脉的数量、长度、棘突数量等作为评价依据。但是在实际的实 验过程中各自存在不足之处；1、利用节间血管作为指标的方法中，需要事先加入血管生成 抑制剂损伤节间血管，再观察药物的促进再生作用。受试药物的作用体现受制于血管生成 抑制剂的作用，受试药物逆转的是采用的抑制剂的作用靶点和通路，筛选的范围受抑制剂 选择的局限。2、以肠下静脉为指标的方法中，由于肠下静脉本身为篮球网状结构，对其拍照 非常困难，斑马鱼拍摄时的体位严重影响肠下静脉的成像，进而影响结果的计算和统计。 中国专利文献CN101179935公开了一种缺血性视网膜组织的血管再生和为此目的 的筛选方法，该筛选方法使用小鼠为模型，以潜在治疗剂向所述小鼠的眼给药;使所述小鼠 安乐死并从给予所述推定治疗剂的所述眼中取出基本上整个视网膜;对给予了所述推定治 疗剂的所述眼的所述视网膜血管系统进行染色并制备显微图像，图像显示所述染色视网膜 中血管闭塞面积和视网膜前新生血管丛面积；同时做对照试验，并将所述染色视网膜中的 视网膜前新血管丛面积与小鼠对照眼的染色视网膜中可观察到的视网膜前血管丛面积进 行比较，该方法受试药物的作用体现受制于血管生成抑制剂的作用，受试药物逆转的是采 用的抑制剂的作用靶点和通路，筛选的范围受抑制剂选择的局限，且步骤繁琐。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术提供一种快速、定量评价化合物对斑马鱼血管生成 促进作用的方法，该方法采用血管特异表达绿色荧光蛋白的转基因斑马鱼，通过直接在斑 马鱼培养用水中加入待测药物，检测斑马鱼尾静脉网的相对面积，成功地建立了一种快速、 定量评价化合物对斑马鱼血管生成促进的方法，具有操作简单、快速、稳定可靠和重复性好 的优点。 术语说明： 尾静脉（tPCV)网面积：指的是斑马鱼躯干泄殖孔至尾尖区域的静脉丛构成的面 积，特指血管转基因斑马鱼的tPCV外围轮廓范围内的面积，图1中虚线圈定的范围为尾静脉 (tPCV)网面积。 尾静脉网对应的节间血管（ISV)区域面积：是指沿泄殖孔画垂直后主动脉(DA)的 直线，直线尾尖侧的部分中，以DA为界，腹侧为tPCV网，背侧为ISV区，图1中实线圈定的范围 为节间血管（ISV)区域面积。hpf(hourspostfertilization):生物学专用术语，指受精后的时间，如24hpf指 受精后24小时的胚胎。 本专利技术的技术方案如下： -种快速、定量评价化合物对斑马鱼血管生成促进作用的方法，包括步骤如下： (1)将受精后21~24h的发育正常斑马鱼胚胎移入培养孔中，对培养孔中的斑马鱼 胚胎连续给药孵育，记为待测化合物组；同时在相同条件下以不给药孵育设置对照，记为对 照组； (2)麻醉孵育后对照组、待测化合物组的每条斑马鱼，采集每条斑马鱼的荧光显微 图像，记录斑马鱼尾部血管荧光情况，测量每组斑马鱼的尾静脉(tPCV)网面积以及尾静脉 网对应的节间血管（ISV)区域面积，按照如下公式计算tPCV网相对面积： tPCV网相对面积=tPCV网面积/对应的节间血管（ISV)区域面积； ⑶定量分析 计算得到的每组斑马鱼tPCV网相对面积以表示，分析比较对照组、待测化合 物组之间差异的显著性； 当待测化合物组斑马鱼的s大于对照组斑马鱼的g:±s，且达到统计学上的显著 性水平(P〈0.05)，待测化合物组斑马鱼的节间血管（ISV)无缺失，说明待测药物对斑马鱼的 血管生成具有促进作用。 根据本专利技术优选的，所述斑马鱼胚胎为血管荧光标记的转基因斑马鱼胚胎。血管 荧光标记的转基因斑马鱼胚胎可采用本领域普通市售产品，如血管荧光转基因斑马鱼Tg (VEGFR2:GFP)，山东省科学院斑马鱼药物筛选中心提供。 根据本专利技术优选的，步骤（1)中，斑马鱼胚胎为21-24hpf的斑马鱼胚胎，最为优选 的，斑马鱼胚胎为24hpf的斑马鱼胚胎。21-24hpf的斑马鱼胚胎鱼尾部血管网尚未形成，为 最理想的给药时间，48hpf的斑马鱼胚胎及以后观察结果，斑马鱼48hpftPCV网的面积在经 过数据处理之后，与药物或环境异物对新生血管的促进作用具有一定相关性。 根据本专利技术优选的，步骤(1)中，所述的给药方式为将斑马鱼胚胎不间断浸泡在药 液中，直至观察结果。根据本专利技术优选的，待测化合物组、对照组每组斑马鱼胚胎总数不少于8枚，孵育 温度为26~30°C，避光孵育，优选的，孵育温度为28°C，孵育时间为1天~1天23h。 根据本专利技术优选的，步骤(2)中斑马鱼的麻醉为采用质量浓度为0.3%。的三卡因浸 泡40~90s进行麻醉。根据本专利技术优选的，步骤(2)中采集图像为将斑马鱼胚胎固定侧面体位固定，在荧 光显微镜下观察、拍照，获得斑马鱼胚胎的侧位图像。进一步优选的，步骤(2)中，采集的图像是在同一的放大倍数下获得的，图像格式 为jpg格式。根据本专利技术优选的，步骤(2)中测量面积为利用图像处理软件ImageJ对采集的图 像进行测量，测量前先校准标尺，得到准确的面积。根据本专利技术优选的，所述步骤(3)中的定量分析，是在待测化合物组斑马鱼的节间 血管（ISV)无缺失条件下进行。也就是说，本专利技术采用tPCV网的相对当前第1页1 2 3 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种快速、定量评价化合物对斑马鱼血管生成促进作用的方法，包括步骤如下：(1)将受精后21h～24hpf的发育正常斑马鱼胚胎移入培养孔中，对培养孔中的斑马鱼胚胎连续给药孵育，记为待测化合物组；同时在相同条件下以不给药孵育设置对照，记为对照组；(2)麻醉孵育后对照组、待测化合物组的每条斑马鱼，采集每条斑马鱼的荧光显微图像，记录斑马鱼尾部血管荧光情况，测量每组斑马鱼的尾静脉(tPCV)网面积以及尾静脉网对应的节间血管(ISV)区域面积，按照如下公式计算tPCV网相对面积：tPCV网相对面积＝tPCV网面积/对应的节间血管(ISV)区域面积；(3)定量分析计算得到的每组斑马鱼tPCV网相对面积以表示，分析比较对照组、待测化合物组之间差异的显著性；当待测化合物组斑马鱼的大于对照组斑马鱼的且达到统计学上的显著性水平(P<0.05)，待测化合物组斑马鱼的节间血管(ISV)无缺失，说明待测药物对斑马鱼的血管生成具有促进作用。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：韩利文，张云，何秋霞，韩建，孙晨，侯海荣，王荣春，彭维兵，王雪，陈锡强，楚杰，刘可春，
申请(专利权)人：山东省科学院生物研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37
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