一种酒精性脂肪肝斑马鱼模型的构建方法技术

本发明专利技术公开了一种酒精性脂肪肝斑马鱼模型的构建方法。步骤如下：实验室驯养AB系野生型斑马鱼，挑选出健康成年斑马鱼随机均分为16组；采用中心组合设计的方法，设计乙醇浓度、暴露时间、试验周期；各组成年斑马鱼按照设计条件完成饲养后，计算该组成年斑马鱼的存活率和平均脂滴面积；将得到的16组存活率和平均脂滴面积分别进行标准差标准化，将各组的存活率标准化值和平均脂滴面积标准化值相加然后除以2得该组成年斑马鱼的综合评分；将各组综合评分进行多元回归分析和二项式拟合得到回归方程，根据回归方程确定酒精性脂肪肝斑马鱼模型的最优造模条件。本发明专利技术成本低、周期短，能够深入研究酒精性脂肪肝病理机制，为酒精性脂肪肝寻找新的治疗手段。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及模式动物疾病模型的构建方法
，具体是一种酒精性脂肪肝斑 马鱼模型的构建方法。
技术介绍
酒精性脂肪肝是由于长期大量饮酒导致的肝脏受损、肝细胞内脂质过度堆积的病 变过程，是酒精性肝病中的一个分型。酒精性脂肪变性过程中发生的肝细胞形态学变化和 代谢变化都会给肝细胞带来更多、更严重的损伤，影响肝脏的正常功能。同其他类型的脂 肪肝相比较，酒精性脂肪肝更容易诱发肝纤维化和肝硬化。由乙醇引起的脂肪肝中20%~ 30%有发展为肝硬化的可能，甚至会导致肝癌。尽管酒精性脂肪肝的发病机制有多种理论 和假说，但均未能涵盖其发生发展的全部过程，也不能圆满解释其临床现象。因此，对于其 病理过程的研究和新型的治疗手段的研制工作就显得尤其重要。 无论是病理研究还是药物的疗效评价均需要良好的动物模型来评价。传统的酒精 性脂肪肝模型常以大鼠作为试验对象，多采用灌胃或腹腔注射乙醇的方法，试验周期约为 8-16周，然而，操作复杂，样本量局限，试验耗费高且周期长等诸多缺点限制了其在高通量 药物筛选方面的应用。为深入酒精性脂肪肝发病机制和防治基础研究，选择一种理想的试 验动物模型十分必要。 目前，斑马鱼已经成为国际上疾病研究最重要的脊椎模式动物之一，并成功应用 于新药筛选中。一方面，与大鼠、小鼠等哺乳类模式生物相比，斑马鱼繁殖周期快、易于饲 养。另一方面，斑马鱼遗传背景清晰，其基因与人类的基因保守度达到85%，具有与人类相 似的造血、神经等系统，器官的病变过程与人类也极为相似，而且斑马鱼价格低廉，非常适 合大批量试验。然而目前，虽然有人用斑马鱼胚胎构建酒精性脂肪肝模型，但其缺点是显而 易见的：采用斑马鱼胚胎作为实验动物，复制的疾病模型与人类疾病相似性较差，不能准确 地诱发出具有类似人类疾病特征的发生机制，从而不能有效地认识酒精性脂肪肝的发生发 展规律，因此胚胎模型仍然不能成为整体动物水平的药物筛选方案。用成年斑马鱼进行构 建酒精性脂肪肝模型的研究工作仍然未见报道。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种相似性高、重复性好、可靠性强、经济易行的酒精性脂肪 肝斑马鱼模型的构建方法。 实现本专利技术目的的技术解决方案为：， 包括以下步骤： 步骤1，实验室驯养AB系野生型斑马鱼，挑选出健康成年斑马鱼用来构建模型； 步骤2,采用中心组合设计的方法设计实验条件，将挑选出的成年斑马鱼随机分为 16组，每组数量相等；所设计的实验条件包括5个乙醇浓度Xp5个暴露时间X 2、5个试验周 期X3，对16组成年斑马鱼分别按照设计的实验条件对应进行饲养； 步骤3,各组成年斑马鱼按照该组对应的实验条件完成饲养后，剔除死亡个体计算 该组成年斑马鱼的存活率，并取出存活的各成年斑马鱼麻醉后取肝组织进行HE染色，做病 理切片确定各条成年斑马鱼的脂滴面积，最终确定该组成年斑马鱼的平均脂滴面积； 步骤4,将步骤4得到的16组成年斑马鱼的存活率和平均脂滴面积两个指标分别 进行标准差标准化得各组的存活率标准化值和平均脂滴面积标准化值，再将各组的存活率 标准化值和平均脂滴面积标准化值相加然后除以2得加权平均值即该组成年斑马鱼的综 合评分； 步骤5,将各组成年斑马鱼的综合评分进行多元回归分析和二项式拟合得到回归 方程，根据回归方程描绘三维曲面图以确定酒精性脂肪肝斑马鱼模型的最优造模条件即乙 醇浓度X 1、暴露时间X2、试验周期X3的最优解。 优选地，步骤1所述实验室驯养AB系野生型斑马鱼，挑选出健康成年斑马鱼用 来构建模型，其中所述AB系野生型斑马鱼为辐鳍鱼纲鲤形目鲤科短担尼尔属野生型斑马 鱼，体长2. 8~3. 2cm，体重0. 20~0. 25g ;所述实验室驯养的条件为于长X宽X高为 30X25X25cm的聚碳酸脂材质缸内饲养4周；所述挑选出的健康成年斑马鱼指体质健壮、 无病无伤、规格一致的个体。 优选地，步骤2所述将挑选出的成年斑马鱼随机分为16组，每组数量相等且均为 15~40条。 优选地，步骤2所述采用中心组合设计的方法设计实验条件，所设计的实验条件 包括5个乙醇浓度Xp5个暴露时间X 2、5个试验周期X3，其中5个乙醇浓度范围为 0. 67% -1. 73% (v/v)、5个暴露时间乂2的范围为0. 94-15. 06小时、5个试验周期X3的范围 为1-27 ;并且： 乙醇浓度X# 0. 67%时，暴露时间X 2为8小时，试验周期X 3为14天； 乙醇浓度X1S 0. 9%时，暴露时间乂2为4-12小时，试验周期X 3为7-21天； 乙醇浓度X1Sl. 2%时，暴露时间乂2为0. 94-15. 06小时，试验周期乂3为1. 6-26. 35 天； 乙醇浓度X1S 1. 5%时，暴露时间乂2为4-12小时，试验周期X 3为7-21天； 乙醇浓度X# 1. 73%时，暴露时间乂2为8小时，试验周期X 3为14天。 优选地，步骤3所述取出存活的各成年斑马鱼麻醉后取肝组织进行HE染色，做病 理切片确定各条成年斑马鱼的脂滴面积，具体为：将取出的成年斑马鱼麻醉后取肝组织，用 0. 7%的生理盐水冲洗干净，投入到10%中性缓冲甲醛固定液中，固定24小时，石蜡包埋， 切片厚度为5 μ m，用苏木素-尹红HE染色，光镜下进行病理学拍照，计算脂滴面积。 进一步地，步骤4所述标准差标准化的公式如下： z = (X- μ ) / 〇 其中，ζ为标准化值，χ为具体分数，μ为平均数，σ为标准差。 进一步地，步骤5所述将各组成年斑马鱼的综合评分进行多元回归分析和二项式 拟合得到回归方程，表达式如下： Y = β 0+ β !X1+ β 2Χ2+ β 3Χ3_ β ^X1X2- β J1X3- β 23Χ2Χ3- β ηΧ!2- β 22Χ22- β 33Χ32; 其中，Y 表示综合评分，β 0、β !、β 2、β 3、β 12、β 13、β 23、β η、β 22、β 33均为回归 方程的系数。 本专利技术与现有技术相比，其显著优点为：⑴采用成年斑马鱼作为实验动物，复制 的疾病模型与人类疾病相似性好，能够更准确地诱发出具有类似人类疾病特征的发生机 制；（2)成本低、周期短、重复性好、可靠性强，可以有效降低药理学实验和药物筛选成本， 深入研究酒精性脂肪肝病理机制，为酒精性脂肪肝寻找新的治疗手段；（3)有助于认识酒 精性脂肪肝的发生发展规律，为推动酒精性脂肪肝医疗事业的发展提供有力基础。【附图说明】 图1是本专利技术酒精性脂肪肝斑马鱼模型的构建方法的流程图。 图2是16组成年斑马鱼的肝组织病理学染色结果图，其中（1)~（16)依次为编 号为1~16的各组成年斑马鱼肝组织病理学染色结果图。 图3是根据回归方程描绘的三维曲面图，其中（a)为乙醇浓度和试验周期交互作 用的三维曲面图，（b)为乙醇浓度和暴露时间交互作用的三维曲面图，（c)为暴露时间和试 验周期交互作用的三维曲面图。【具体实施方式】 下面结合附图及具体实施例对本专利技术做出进一步详细说明。 结合图1，本专利技术酒精性脂肪肝斑马鱼模型的构建方法，包括以下步骤： 步骤1，实验室驯养AB系野生型斑马鱼，挑选出健康成年斑马鱼用来构建模型； 步骤2,采用中心组合设计的方法设计实验条件，将挑选出的成年斑马鱼随机分为 16组，每组数量相等；所本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种酒精性脂肪肝斑马鱼模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，实验室驯养AB系野生型斑马鱼，挑选出健康成年斑马鱼用来构建模型；步骤2，采用中心组合设计的方法设计实验条件，将挑选出的成年斑马鱼随机分为16组，每组数量相等；所设计的实验条件包括5个乙醇浓度X1、5个暴露时间X2、5个试验周期X3，对16组成年斑马鱼分别按照设计的实验条件对应进行饲养；步骤3，各组成年斑马鱼按照该组对应的实验条件完成饲养后，剔除死亡个体计算该组成年斑马鱼的存活率，并取出存活的各成年斑马鱼麻醉后取肝组织进行HE染色，做病理切片确定各条成年斑马鱼的脂滴面积，最终确定该组成年斑马鱼的平均脂滴面积；步骤4，将步骤4得到的16组成年斑马鱼的存活率和平均脂滴面积两个指标分别进行标准差标准化得各组的存活率标准化值和平均脂滴面积标准化值，再将各组的存活率标准化值和平均脂滴面积标准化值相加然后除以2得加权平均值即该组成年斑马鱼的综合评分；步骤5，将各组成年斑马鱼的综合评分进行多元回归分析和二项式拟合得到回归方程，根据回归方程描绘三维曲面图以确定酒精性脂肪肝斑马鱼模型的最优造模条件即乙醇浓度X1、暴露时间X2、试验周期X3的最优解。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：汪俊松，陈婷，李明会，
申请(专利权)人：南京理工大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32