一种获取转基因牛胎儿成纤维细胞的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用单一Cas9切口酶介导NRAMP1定点插入获取转基因牛胎儿成纤维细胞的方法，本发明专利技术通过电穿孔的方法将供体载体和针对打靶位点的单一CRISPR/Cas9切口酶表达载体共转染牛胎儿成纤维细胞，供体载体中NRAMP1基因自身启动子可以使NRAMP1实现在专职吞噬性细胞中的特异性表达，嘌呤霉素药物筛选后，经过PCR和Southern Blotting鉴定获得打靶的阳性克隆细胞。以该转基因阳性克隆细胞为核供体，可获得转基因克隆胚胎，进一步将转基因克隆胚胎移植到发情的受体牛子宫内，最终可以获得成活的NRAMP1定点插入转基因克隆牛。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于转基因克隆动物
，涉及转基因克隆牛的核供体细胞的构建，特别涉及一种利用单一Cas9切口酶介导NRAMP1基因定点插入获取打靶的牛胎儿成纤维细胞的方法。
技术介绍
结核病是一种由结核分支杆菌(Mycobacteriumtuberculosis,MTB)在人与牛之间传播引起的世界性人畜共患病，对畜牧业生产安全、畜产品安全乃至人类健康造成了严重威胁。NRAMP1(naturalresistance-associatedmacrophageprotein-1)又名SLC11A1(solutecarrierfamily11Amember1)，是研究者发现的首个与结核杆菌易感性相关的基因(VidalSetal,1995)。在结核杆菌侵入巨噬细胞时，NRAMP1通过参与先天免疫过程促进NO产生和其它促炎症反应(HedgesJF,2013)从而抑制结核杆菌在胞内的增殖，产生抗病效果。2013年2月，国际著名期刊《Cell》报道了加州大学旧金山分校的研究人员所发现的一种精确沉默基因的方法，称之为CRISPR/Cas9介导的打靶技术。该技术表现出许多优越性，例如可以同时沉默任意数量的基因、具有优良的靶向性、构建简单且成本低等。该技术自专利技术以来，迅速被广大中外研究人员应用于人类细胞以及小鼠等模式动物研究中，成为当今生命科学技术研究的新热点。应用转基因技术实现家畜的品种改良具有巨大的应用潜力。通过转基因技术增强家畜对于结核杆菌的抗性，对于未来的牛结核病的预防和治疗具有重大意义。然而，目前CRISPR/Cas9技术介导的基因插入在转基因家畜中的应用非常有限。此外，如何在保证外源基因插入效率的同时，减弱该系统多变的脱靶效应至今依然亟待解决。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种利用单一Cas9切口酶介导NRAMP1定点插入获取转基因牛胎儿成纤维细胞的方法，可以采用单一Cas9切口酶与NRAMP1巨噬细胞特异性表达打靶载体获取NRAMP1基因在牛25号染色体F-A位点(即牛FSCN1基因和ACTB基因间区域内特定序列片段)定点整合的牛胎儿成纤维细胞，以该细胞作为核供体细胞，为研制抗结核病的转基因牛提供坚实的基础。为达到上述目的，本专利技术采用了以下技术方案：一种NRAMP1巨噬细胞特异性表达打靶载体(简称pNRAMP1-eGFP-P2A-Puro)，该打靶载体包括目的基因NRAMP1以及用于将NRAMP1基因通过同源重组定点插入牛25号染色体FSCN1和ACTB基因间的元件序列。所述元件序列包括用于打靶位点同源重组的同源臂序列，同源臂以牛基因组为模板扩增，扩增产物分别为牛25号染色体上打靶位点的上游577-977bp和下游616-1016bp；打靶位点位于牛25号染色体FSCN1和ACTB基因间如SEQ.ID.NO.1所示的序列内。所述目的基因NRAMP1是由外源扩增的NRAMP1基因自身启动子启动转录的。所述元件序列还包括筛选标记eGFP基因和PURO基因，这两个筛选标记基因都由EF1α启动子启动转录，并由自剪切肽P2A序列串联融合表达。所述元件序列还包括位于两个筛选标记基因两侧的两个同向LoxP序列。一种插入目的基因NRAMP1的牛胎儿成纤维细胞的构建方法，包括以下步骤：以牛胎儿成纤维细胞为宿主细胞，通过共转染打靶载体pNRAMP1-eGFP-P2A-Puro和针对打靶位点的单一CRISPR/Cas9切口酶表达载体，将目的基因NRAMP1定点整合到牛胎儿成纤维细胞的25号染色体FSCN1和ACTB基因间。所述宿主细胞为传代2～3代的荷斯坦奶牛胎儿成纤维细胞，以兼顾细胞数量与活性。所述共转染操作采用电穿孔法。所述单一CRISPR/Cas9切口酶表达载体包含有与打靶位点相对应的向导序列，打靶位点位于牛25号染色体FSCN1和ACTB基因间如SEQ.ID.NO.1所示的序列内。所述插入目的基因NRAMP1的牛胎儿成纤维细胞可作为生产转基因克隆牛的核移植操作供体细胞使用。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益的技术效果：1.本专利技术构建了一种NRAMP1巨噬细胞特异性表达打靶载体pNRAMP1-eGFP-P2A-Puro，并通过基因打靶技术使NRAMP1基因定点整合到牛25号染色体F-A位点。该位点附近基因簇为持家基因，在不同组织中均处于活跃表达状态。将NRAMP1插入该区域，可以避免其因异染色质化修饰而丧失活性。2.本专利技术构建了一种NRAMP1巨噬细胞特异性表达打靶载体pNRAMP1-eGFP-P2A-Puro，可通过单一CRISPR/Cas9切口酶来介导其整合到F-A位点。单一CRISPR/Cas9切口酶可以减少打靶过程中非同源末端重组修复(NHEJ)在基因组范围内引入额外的突变(indels)，从而减少细胞毒性，提高转基因动物的安全性。3.本专利技术构建了一种NRAMP1巨噬细胞特异性表达打靶载体pNRAMP1-eGFP-P2A-Puro，其目的基因NRAMP1由外源扩增的该基因自身启动子启动转录。从而使目的基因NRAMP1在且仅在专门性的吞噬细胞中正常转录和表达，提高转基因动物生产的安全性。4.本专利技术构建了一种NRAMP1巨噬细胞特异性表达打靶载体pNRAMP1-eGFP-P2A-Puro，该打靶载体内包含有筛选标记基因PURO，方便药物筛选获取阳性克隆细胞；包含有筛选标记基因eGFP，方便在荧光显微镜下直接确定外源基因的插入。同时筛选标记两侧的同向LoxP可与cre酶共同作用，去除阳性克隆细胞中的筛选标记。5.本专利技术获取的插入目的基因NRAMP1的牛胎儿成纤维细胞，经PCR和SouthernBlotting鉴定，证实目的基因为定点整合到牛胎儿成纤维细胞基因组F-A位点。6.以插入目的基因NRAMP1的牛胎儿成纤维细胞作为核移植供体细胞，可以通过SCNT获得转基因克隆牛，为获得对结核病具有更强抗性的新品种转基因牛打下坚实的基础。附图说明图1是将打靶位点对应的向导序列克隆至Cas9表达载体的原理图。图2是Cas9真核表达载体的图谱。图3是利用Surveyornucleaseassay对Cas9切割活性的检测图。图4是打靶载体pNRAMP1-eGFP-P2A-Puro的图谱。图5是原代培养(A)及传代培养(B)中的用于基因打靶的牛胎儿成纤维细胞。图6是转染打靶载体的牛胎儿成纤维细胞经嘌呤霉素筛选出来的单克隆细胞图。图7是阳性单克隆细胞鉴定示意图。图8是选取一些具有代表性的单克隆细胞的junctionPCR鉴定结果图。图9是对经PCR验证为发生了NRAMP1基因定点整合的14个单克隆细胞进行Southernblotting验证的结果图。图10是利用基因打靶的阳性克隆细胞制备的转基因克隆胚胎。图11是利用基因打靶的阳性克隆细胞制备的转基因克隆牛。具体实施方式下面结合附图和实施例对本专利技术做进一步详细说明。所述是对本专利技术的解释，而不是限定。本专利技术首先构建了含有NRAMP1基因的巨噬细胞特异性表达的打靶载体pNRAMP1-eGFP-P2A-Puro，然后通过电穿孔的方法将打靶载体pNRAMP1-eGFP-P2A-Puro和针对打靶位点的单一CRISPR/Cas9切口酶表达载体共转染牛胎儿成纤维细胞，嘌呤霉素药物本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种NRAMP1巨噬细胞特异性表达打靶载体，其特征在于：该打靶载体包括目的基因NRAMP1以及用于将NRAMP1基因通过同源重组定点插入牛25号染色体FSCN1和ACTB基因间的元件序列。

【技术特征摘要】
1.一种NRAMP1巨噬细胞特异性表达打靶载体，其特征在于：该打靶载体包括目的基因NRAMP1以及用于将NRAMP1基因通过同源重组定点插入牛25号染色体FSCN1和ACTB基因间的元件序列。2.根据权利要求1所述一种NRAMP1巨噬细胞特异性表达打靶载体，其特征在于：所述元件序列包括用于打靶位点同源重组的同源臂序列，同源臂以牛基因组为模板扩增，扩增产物分别为牛25号染色体上打靶位点的上游577-977bp和下游616-1016bp；打靶位点位于牛25号染色体FSCN1和ACTB基因间如SEQ.ID.NO.1所示的序列内。3.根据权利要求1所述一种NRAMP1巨噬细胞特异性表达打靶载体，其特征在于：所述目的基因NRAMP1是由外源扩增的NRAMP1基因自身启动子启动转录的。4.根据权利要求1所述一种NRAMP1巨噬细胞特异性表达打靶载体，其特征在于：所述元件序列还包括筛选标记eGFP基因和PURO基因，这两个筛选标记基因都由EF1α启动子启动转录，并由自剪切肽P2A序列串联融合表达。5.根据权利要求4所述一种NRAMP1巨噬细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：张涌，高元鹏，陈琳琳，刘鑫，吴海波，袁梦珂，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61