一种高效的酵母双杂交三框文库构建技术制造技术

本发明专利技术涉及一种高效的酵母双杂交三框文库构建技术，包括用于高效酵母双杂交三框文库构建的重组载体，所述重组载体有三种，所述三种重组载体是在原始PGADT7载体分别插入碱基序列1、碱基序列2和碱基序列3构建而成，所述碱基序列1的核苷酸序列为SEQ ID NO：1，所述碱基序列2的核苷酸序列为SEQ ID NO：2，所述碱基序列3的核苷酸序列为SEQ ID NO：3。还包括上述载体的构建方法及利用上述载体构建酵母双杂交三框文库的构建方法。本发明专利技术通过重组载体构建酵母双杂交三框文库，能够有效降低假阴性率，并且成本较为低廉。

【技术实现步骤摘要】
一种高效的酵母双杂交三框文库构建技术
本专利技术属生物
，具体涉及一种高效的酵母双杂交三框文库构建技术。
技术介绍
酵母双杂交技术在研究两个已知蛋白间相互作用以及利用酵母双杂交技术高通量筛选已知获得未知蛋白方面具有广泛的用途，且近年来取得长足发展。酵母双杂交技术的优化改进一直是为降低酵母双杂交筛选的假阳性或者假阴性的产生而设计的。而文库的质量是以上目的的达成关键。Clontech公司研发的mat&plate文库，在合适的选择培养基上，将酵母猎物蛋白文库和诱饵菌株通过mating的方式共培养筛选出与已知蛋白相互作用的猎物蛋白。其文库构建的原理是利用了酿酒酵母体内本底的高效的同源重组机制。在Y187酵母菌内完成载体和双链cDNA的同源重组。是一种高效的文库构建筛选策略，但是由于酵母双杂交筛选技术是在蛋白水平上研究两个蛋白之间相互作用的。其构建的为表达文库，被构建的双链CDNA最终是需要翻译成蛋白起到筛选作用的。上述文库存在假阴性较高的问题。因此开发一种高效的可以起修复矫正作用的三框文库技术，增加文库筛选的有效滴度，降低筛选的假阴性率是我们亟待解决的问题。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术中存在的不足，提供一种高效的酵母双杂交三框文库构建技术，通过重组载体构建酵母双杂交三框文库，能够有效降低假阴性率，并且成本较为低廉。为解决上述问题，本专利技术的技术方案如下：本专利技术保护一种用于高效酵母双杂交三框文库构建的重组载体，所述重组载体有三种，所述三种重组载体是在原始PGADT7载体分别插入碱基序列1、碱基序列2和碱基序列3构建而成，所述碱基序列1的核苷酸序列为SEQIDNO：1，所述碱基序列2的核苷酸序列为SEQIDNO：2，所述碱基序列3的核苷酸序列为SEQIDNO：3。本专利技术还保护上述用于高效酵母双杂交三框文库构建的重组载体的构建方法，包括以下步骤：步骤1)，全基因合成碱基序列1、碱基序列2和碱基序列3，所述碱基序列1的核苷酸序列为SEQIDNO：1，所述碱基序列2的核苷酸序列为SEQIDNO：2，所述碱基序列3的核苷酸序列为SEQIDNO：3；步骤2)，SfiI单酶切原始PGADT7载体并回收酶切载体备用；步骤3)，将步骤1)合成的碱基序列1、碱基序列2和碱基序列3连接到步骤2)得到的酶切载体中，得到三种重组载体。在上述技术方案的基础上，本专利技术还能够有如下改进。进一步，所述步骤2)中，用PCR产物回收试剂盒回收酶切载体。本专利技术还保护采用上述重组载体的用于高效酵母双杂交三框文库的构建方法，包括以下步骤：步骤a，双链cDNA制备：提取总RNA，分离出mRNA，经逆转录PCR合成单链cDNA，再通过LD-PCR以单链cDNA扩增获得双链cDNA；步骤b，构建重组载体：在原始PGADT7载体分别插入碱基序列1、碱基序列2和碱基序列3构建三种重组载体；步骤c，重组产物的制备，将步骤a得到的双链cDNA与等摩尔比混合的步骤b得到的三种重组载体的酶切载体进行infusine体外同源重组反应，得到重组产物；步骤d，转化到大肠杆菌：将步骤c得到的重组产物转化到新鲜制备的大肠杆菌感受态细胞DH10b；步骤e，文库测序鉴定。在上述技术方案的基础上，本专利技术还能够有如下改进。进一步，所述步骤a中，经LD-PCR后，还需要对PCR产物进行纯化。进一步，所述步骤b中，所述双链cDNA与等摩尔比混合的三种重组载体的酶切载体按照总摩尔比3:1的比例混合。本专利技术的有益效果是：本专利技术采用特定设计的碱基序列构建重组的PGADT7载体，并利用上述重组载体构件三框文库，这种方式构建的全基因组cDNA文库中的每个基因三种读码方式的基因占比基本相当，且可以保证全基因组文库中每个基因在三种不同的读码方式中均存在唯一的正确读码翻译的基因，三种读码框可以有效纠正随机引物扩增获得的双链cDNA构建带来的随机移码突变的问题，可以有效降低筛选的假阴性率；本专利技术采用载体改造的方式而非引物带入突变的方式，只用经过一轮LD-PCR反应，而非三轮PCR，可以有效避免多次PCR带来的转录本的突变，保证每个读码框的双链cDNA样本均一性，且成本较低。附图说明图1为本专利技术第一种重组载体的质粒图谱；图2为本专利技术第二种重组载体的质粒图谱；图3为本专利技术第三种重组载体的质粒图谱。具体实施方式以下对本专利技术的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。本专利技术设计了一种用于高效酵母双杂交三框文库构建的重组载体，所述重组载体有三种，所述三种重组载体是在原始PGADT7载体分别插入碱基序列1、碱基序列2和碱基序列3构建而成，所述碱基序列1的核苷酸序列为SEQIDNO：1，所述碱基序列2的核苷酸序列为SEQIDNO：2，所述碱基序列3的核苷酸序列为SEQIDNO：3。目前，限制酵母双杂交技术应用的关键在于文库的质量，现有的酵母双杂交文库均存在假阴性的问题。专利技术人经过研究发现，目前文库的构建主要采用引物带入突变的方式，而上述方式需要多轮PCR，而多次PCR可能会带来的转录本的突变，从而导致假阴性的问题产生。上述发现并未见公开文献报道，属于专利技术人研究发现的新的技术问题。而
技术介绍
中提到的Clontech公司研发的mat&plate文库构建技术。是采购随机引物扩增的双链cDNA，这样获得的双链cDNA存在2/3的概率会存在移码错读而被翻译成一个错误的蛋白进而稀释了cDNA文库在筛选环节的有效滴度，专利技术人推测这也是造成酵母双杂交技术假阴性高的一个重要的原因。基于专利技术人的研究发现，本专利技术采用载体改造的方式，利用合成的碱基序列组插入现有的原始PGADT7载体中，重组改造出新的载体，并利用重组载体构建三框文库。这样的方式构建的酵母双杂交文库仅仅只需要一轮LD-PCR反应，有效避免了多次PCR带来的转录本突变的风险，从而有效解决了假阴性率高的问题。本专利技术有效解决本领域一直渴望解决但未能解决的假阴性的技术问题。本专利技术的重组载体的构建方法，包括以下步骤：步骤1)，全基因合成碱基序列1、碱基序列2和碱基序列3，所述碱基序列1的核苷酸序列为SEQIDNO：1，所述碱基序列2的核苷酸序列为SEQIDNO：2，所述碱基序列3的核苷酸序列为SEQIDNO：3；步骤2)，SfiI单酶切原始PGADT7载体并回收酶切载体备用；步骤3)，将步骤1)合成的碱基序列1、碱基序列2和碱基序列3连接到步骤2)得到的酶切载体中，得到三种重组载体，分别命名为PGADT7(SfiI-1)、PGADT7(SfiI-2)和PGADT7(SfiI-3)。本专利技术三种重组载体PGADT7(SfiI-1)、PGADT7(SfiI-2)和PGADT7(SfiI-3)的质粒图谱见图1～图3。优选的，所述步骤2)中，用PCR产物回收试剂盒回收酶切载体。...

【技术保护点】
1.一种用于高效酵母双杂交三框文库构建的重组载体，其特征在于：所述重组载体有三种，所述三种重组载体是在原始PGADT7载体分别插入碱基序列1、碱基序列2和碱基序列3构建而成，所述碱基序列1的核苷酸序列为SEQ ID NO：1，所述碱基序列2的核苷酸序列为SEQ ID NO：2，所述碱基序列3的核苷酸序列为SEQ ID NO：3。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于高效酵母双杂交三框文库构建的重组载体，其特征在于：所述重组载体有三种，所述三种重组载体是在原始PGADT7载体分别插入碱基序列1、碱基序列2和碱基序列3构建而成，所述碱基序列1的核苷酸序列为SEQIDNO：1，所述碱基序列2的核苷酸序列为SEQIDNO：2，所述碱基序列3的核苷酸序列为SEQIDNO：3。


2.一种权利要求1所述用于高效酵母双杂交三框文库构建的重组载体的构建方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤1)，全基因合成碱基序列1、碱基序列2和碱基序列3，所述碱基序列1的核苷酸序列为SEQIDNO：1，所述碱基序列2的核苷酸序列为SEQIDNO：2，所述碱基序列3的核苷酸序列为SEQIDNO：3；
步骤2)，SfiI单酶切原始PGADT7载体并回收酶切载体备用；
步骤3)，将步骤1)合成的碱基序列1、碱基序列2和碱基序列3连接到步骤2)得到的酶切载体中，得到三种重组载体。


3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤2)中，用PCR产物回收试剂盒回收酶切载体。


4.一种采...

【专利技术属性】
技术研发人员：李昆鹏，李敏，
申请(专利权)人：武汉金开瑞生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42