生产羟基红景天苷的重组质粒和基因工程菌及其运用制造技术

本发明专利技术涉及生物工程领域，具体公开了生产羟基红景天苷的重组质粒和基因工程菌及其运用。本发明专利技术将酪氨酸羟化酶BvTH、AAS酶基因和糖苷化酶UGTs基因分别克隆到质粒载体pTrc99a上，获得重组质粒PTAX4511与RrTG1068，再将重组后的质粒转入工程菌NVSL4869中，通过酪氨酸羟化酶BvTH、AAS酶基因和糖苷化酶UGTs基因的过量表达使酿酒酵母获得生产目标酶的能力从而达到生产羟基红景天苷的目的。本发明专利技术的菌株和质粒能够在不影响酿酒酵母自身生存的条件下，利用酪氨酸为底物生产重要药物分子红景天苷的下游衍生物‑羟基红景天苷，从而拓宽红景天苷在药理学和医学上的应用。

【技术实现步骤摘要】
生产羟基红景天苷的重组质粒和基因工程菌及其运用
本专利技术涉及生物工程领域，具体涉及生产羟基红景天苷的重组质粒和基因工程菌及其运用。
技术介绍
红景天在多国的医学史上都有使用记载，现代研究发现红景天能促进红细胞携氧的能力，对高原反应有着很好的疗效，同时对免疫系统有较好的调节作用。红景天具有降血糖、抗氧化应激、抑制血管平滑肌增殖等多种调节机制，可以有效治疗糖尿病血管并发症,用于人体各种系统疾病的治疗，充分体现的是其免疫调节、抗氧化应激的功能，作为一种中药适应原，对人体器官都具有一定的调节保护作用，因此红景天在各种疾病的治疗中也越来越受欢迎。红景天最有价值或者说潜力最大的一点是其具有抗肿瘤活性，研究表明红景天注射液能改善肿瘤患者体内的各种细胞免疫功能，可用于肺癌、乳腺癌等的治疗，可以有效抑制肿瘤细胞的增值和转移，中药红景天和其他抗肿瘤药物的联合用药能够发挥极高的疗效。目前，大部分红景天苷都是以红景天植物为原料，通过提取的方法获得，但是提取成本高，产量低。红景天植株本身的产量并不高，而且生长在高海拔的严寒地区，其产量受土地和气候等环境因素的影响，无法满足日益增长的需求。与此同时，传统的化学合成方法存在各种环境问题，例如合成过程中产生的废水等往往具有污染性且不易处理，不符合绿色发展的路线。随着合成生物学的发展与应用，利用基因工程筛选、构建相应的目标工程菌来对目标产物进行发酵，成为了新的合成以及发展衍生物研究热点。随着人们可持续发展意识和环保意识的提高，发酵法生产进入了人们的视线，引起了研究热潮。为响应绿色化工的发展要求，合成生物学的研究范围进一步扩大，技术逐渐成熟。许多药物分子的微生物合成已经实现，例如人参皂苷，灯盏花素等。目前全世界对红景天苷等药物的需求日益增长，为满足药物研究的需求，发展下游衍生物是很有必要的。羟基红景天苷(Hydroxysolisade)是红景天苷的羟基化产物，化学式为C14H18O8是红景天苷的羟基衍生物，羟基红景天苷的发酵研究文献报道相对较少。综合已有研究红景天苷的文献来看，菌种研究方面，比较有应用前景的菌种包括基因改造的大肠杆菌和酵母菌。这两种菌都是通过混合酸发酵产能，但是酵母菌作为真核生物，代谢条件更接近天然植物，在代谢糖苷化酶上更具有优势。同时，酿酒酵母菌株本身培养条件简单，有代谢灵活，易于改造的特性。对工程酿酒酵母生产羟基红景天苷的途径研究表明，该途径的关键步骤是将酪氨酸催化成羟基酪醇(Hydroxytyrosol)，产生的羟基酪醇随后被糖苷化酶(UGTs)转化为羟基红景天苷。专利CN201711479443.3公开了一种生产酪醇和/或红景天苷的重组酿酒酵母菌株，外源基因包括AROL基因、PcAAS基因、AtUgt85A1基因、ARO4*基因和ARO7*基因。其将酪醇和/或红景天苷的生物合成途径中五个关键酶编码基因导入酿酒酵母中，使这些基因在酿酒酵母中进行过表达；调控从葡萄糖到酪氨酸的代谢流，来增强酪醇和红景天苷的生物合成，从而实现酿酒酵母由葡萄糖从头合成酪醇和红景天苷的途径构建。其合成过程需调控葡萄糖等底物，菌体会受到代谢产物的影响，并且未记载后续如何生成羟基红景天苷。综上，亟需一种生产羟基红景天苷的方法，实现由价格便宜的酪氨酸来合成稀有药物分子，拓宽红景天苷分子库的创新性方法。
技术实现思路
本专利技术为了解决上述问题，本专利技术提供了一种生产羟基红景天苷的重组质粒组合物和基因工程菌及其运用。本专利技术目的之一在于提供一种用于生产羟基红景天苷的重组质粒，充分利用重组质粒生产重要药物分子的优势，拓宽红景天苷的分子库，构建新的羟基红景天苷的生物合成路径，具体技术方案如下：一种用于生产羟基红景天苷的重组质粒组合物，所述重组质粒组合物由PTAX4511重组质粒和RrTG1068重组质粒组成，所述PTAX4511重组质粒携带BvTH基因和AAS酶基因，所述RrTG1068重组质粒携带UGTs基因；所述BvTH基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述AAS酶基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，所述UGTs基因的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。本专利技术目的之二在于提供一种用于生产羟基红景天苷的工程菌，具体技术方案如下：上述方案中所述重组质粒组合物转入到酿酒酵母中得到的PVCL4869工程菌，所述PVCL4869工程菌包括BvTH基因，AAS酶基因和UGTs基因。本专利技术目的之三在于提供上述PVCL4869工程菌在制备羟基红景天苷中的应用。进一步地，所述PVCL4869工程菌与L-酪氨酸发酵制备得到羟基红景天苷。本专利技术目的之四在于提供一种生产羟基红景天苷的方法，具体技术方案如下：一种生产羟基红景天苷的方法，具体步骤包括：(1)制备权利要求1所述的重组质粒组合物；(2)工程菌的制备：将步骤(1)所述的重组质粒组合物转入酿酒酵母菌中，得到PVCL4869工程菌；(3)羟基红景天苷的的制备：将所述PVCL4869工程菌与L-酪氨酸发酵得到羟基红景天苷。进一步地，步骤(1)的具体步骤包括：1)设计并选定引物，2)纯化PCR产物，连接pTrc99a载体，分别得到PTAX4511重组质粒和RrTG1068重组质粒。进一步地，步骤1)中所述设计引物为：Lys0X-F:5'-catgccatggatgacaatgttgactttgctgaat-3'Lys0X-R:5'-cgggtaccttagatcttcacctggtactccttg-3'；gcd-F:5'-cggggtaccatggcaattaacaatacaggctcgc-3'gcd-R:5'-cgagctcttacttcacatcatccggcagcgca-3'；dpka-F:5'-cgagctcagaggaattcaccatgtccgcacc-3'dpka-R:5'-tgctctagagcctcagccaagcagctctttcaggc-3’；lysQ-F:5'-tgctctagaatggtttccgaactaaaaccacag-3'lysQ-R:5'-cccaagcttttatttcttatcgttctgcgggaac-3'。作为优选的，制备所述PTAX4511重组质粒选取的引物为：dpka-F:5'-cgagctcagaggaattcaccatgtccgcacc-3'dpka-R:5'-tgctctagagcctcagccaagcagctctttcaggc-3’；制备所述RrTG1068重组质粒选取的引物为：lysQ-F:5'-tgctctagaatggtttccgaactaaaaccacag-3'lysQ-R:5'-cccaagcttttatttcttatcgttctgcgggaac-3'。进一步地，步骤(2)中所述酿酒酵母菌为NVSL4869工程菌。进一步地，步骤(3)中所述L-酪氨酸浓度为6g/L。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于生产羟基红景天苷的重组质粒组合物，其特征在于，所述重组质粒组合物由PTAX4511重组质粒和RrTG1068重组质粒组成，所述PTAX4511重组质粒携带BvTH基因和AAS酶基因，所述RrTG1068重组质粒携带UGTs基因；所述BvTH基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，所述AAS酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述UGTs基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于生产羟基红景天苷的重组质粒组合物，其特征在于，所述重组质粒组合物由PTAX4511重组质粒和RrTG1068重组质粒组成，所述PTAX4511重组质粒携带BvTH基因和AAS酶基因，所述RrTG1068重组质粒携带UGTs基因；所述BvTH基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述AAS酶基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，所述UGTs基因的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。


2.权利要求1中所述重组质粒组合物转入到酿酒酵母中得到的PVCL4869工程菌，其特征在于，所述PVCL4869工程菌包括BvTH基因，AAS酶基因和UGTs基因。


3.权利要求2所述的PVCL4869工程菌在制备羟基红景天苷中的应用。


4.一种生产羟基红景天苷的方法，其特征在于，具体步骤包括：
(1)制备权利要求1所述的重组质粒组合物；
(2)工程菌的制备：将步骤(1)所述的重组质粒组合物转入酿酒酵母菌中，得到PVCL4869工程菌；
(3)羟基红景天苷的的制备：将所述PVCL4869工程菌与L-酪氨酸发酵得到羟基红景天苷。


5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)的具体步骤包括：
1)设计并选定引物，
2)纯化PCR产物，连接pTrc99a载体，分别得到PTAX4511重组质粒和RrTG1068重组质粒。


6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述设计引物为：
Lys0X-F:5'-catgccatggatgacaatgttgactttgctgaat-3'
Lys0X-R:5'-cgggtaccttagatcttcacctggtactccttg-3'...

【专利技术属性】
技术研发人员：王丹，罗若诗，杨锡志，徐彦芹，秦钊，周丹，高鑫，张进许，
申请(专利权)人：重庆大学，
类型：发明
国别省市：重庆;50