转化辅助用质粒和使用其的转化物的制造方法以及转化方法技术

本发明专利技术的课题是，简便且高效地制作使目的基因组入基因组的稳定转化物。一种转化物的制造方法，具有将具有目的基因的线状基因组导入核酸片段和具有用于组入该线状基因组导入核酸片段的一对同源重组序列的转化辅助用质粒导入宿主、筛选上述目的基因组入上述宿主基因组中的上述规定位置、表达上述目的基因的转化物的工序。

【技术实现步骤摘要】
转化辅助用质粒和使用其的转化物的制造方法以及转化方法
本专利技术涉及对宿主导入目的基因时使用的转化辅助用质粒、使用该转化辅助用质粒的转化物的制造方法、使用该转化辅助用质粒的转化方法。
技术介绍
一般，将从外部将目的基因导入宿主细胞的技术称为转化或者基因重组，将该导入了目的基因的细胞称为转化物或重组物。通过利用转化技术高效地制作转化物，例如可以利用合成生物学方法进行微生物代谢工程加速-高效化。这里，合成生物学方法是使生产宿主的设计-构建-评价-学习的周期迅速运转成立的技术。其中，在以酵母为宿主的合成生物学中，高效的宿主构建、即能够高效地制作重组酵母是一个重要课题。以酵母为宿主的转化大体分为使用组入有目的基因的环状质粒的方法和使用含有目的基因的线状载体的方法。使用环状质粒将目的基因导入酵母是容易的，能够以10-2左右的高效率制作转化酵母(非专利文献1)。另一方面，使用线状载体将目的基因导入酵母时，有必要通过同源重组使目的基因组入基因组，因此仅能以10-6左右的效率制作转化酵母(非专利文献2)。使用环状质粒将目的基因导入酵母的方法虽然如上所述效率高，但也存在环状质粒脱落的情况，无法制作稳定的重组酵母。另一方面，使用线状载体将目的基因导入酵母的方法中，虽然由于目的基因组入基因组，是稳定的，但如上所述，说不上是效率高的方法。已知下述技术：为了提高目的基因对基因组的导入效率，在基因组中的导入预定部位预先导入归巢核酸内切酶等靶特异性核酸内切酶的靶序列，切割该部位的双链(非专利文献2)。此外还已知下述技术：代替靶特异性核酸内切酶，使用CRISPR-Cas9、TALEN等能够切割任意碱基序列的技术，同样地切割基因组中的导入预定部位的双链(非专利文献3)。以这种方式，通过对导入目的基因的部位的双链进行切割，能够使同源重组效率提高至10-2～10-1左右。然而，在这些提高目的基因的导入效率的方法中，有必要在基因组中的导入预定部位预先导入核酸内切酶的靶序列，或者，有必要制作针对目标部位的向导RNA等。以这种方式，这些提高目的基因的导入效率的方法是除了制作包含目的基因的同源重组用DNA片段、用其进行转化以外还需要有各种工序的复杂的方法。此外，专利文献1中公开了具有将归巢核酸内切酶靶序列用端粒种子序列夹着的构成的内含子的筛选标记的质粒。专利文献1中公开的该质粒通过归巢核酸内切酶的表达从环状质粒转变为线状分子，可以利用末端的端粒种子序列稳定存在。现有技术文献专利文献专利文献1：US2016/0017344非专利文献非专利文献1：Gietz,R.D.,等“利用LiAc/SS载体DNA/PEG法的高效酵母转化(High-efficiencyyeasttransformationusingtheLiAc/SScarrierDNA/PEGmethod)”NatureProtocols.2(2007):31-34.非专利文献2：Storici,F,等“酵母中的染色体位点特异性双链断裂被寡核苷酸有效地靶向修复(Chromosomalsite-specificdouble-strandbreaksareefficientlytargetedforrepairbyoligonucleotidesinyeast)”Proc.Natl.Acad.Sci.USA.100(2003):14994-14999.非专利文献3：DiCarlo,J.E.,等“使用CRISPR-Cas系统在酿酒酵母中进行基因组工程(GenomeengineeringinSaccharomycescerevisiaeusingCRISPR-Cassystems)”NucleicAcidsRes.41(2013):4336-4343.专利技术概述专利技术所要解决的课题然而，上述任何方法均存在无法简便且高效地制作使目的基因组入基因组的稳定转化物的问题。因此，鉴于上述实际情况，本专利技术的目的在于，提供能够简便且高效地制作使目的基因组入基因组的稳定转化物的转化物的制造方法和转化方法、以及能够用于这些方法的转化辅助用质粒。用于解决课题的方法本专利技术实现了上述目的，包括以下方案。(1)一种转化物的制造方法，具有：将具有用于导入至基因组上的规定位置的目的基因的1种或多种线状基因组导入核酸片段和具有用于组入该线状基因组导入核酸片段的一对同源重组序列的转化辅助用质粒导入宿主的工序，其中，配置用于在上述线状基因组导入核酸片段组入转化辅助用质粒的状态下在上述目的基因外侧和基因组的规定位置进行同源重组的一对同源重组序列和在该一对同源重组序列外侧的一对核酸内切酶靶序列，以及筛选上述目的基因组入上述宿主基因组中的上述规定位置、表达上述目的基因的转化物的工序。(2)根据(1)所述的转化物的制造方法，其特征在于，上述转化辅助用质粒具有与上述线状基因组导入核酸片段中的目的基因外侧同源重组的一对同源重组序列和在介由该同源重组序列而组入上述线状基因组导入核酸片段的位置的相反侧配置的一对核酸内切酶靶序列。(3)根据(1)所述的转化物的制造方法，其特征在于，上述线状基因组导入核酸片段在夹着上述目的基因的位置具有用于组入上述基因组的规定位置的上述一对同源重组序列、在该一对同源重组序列外侧具有上述一对核酸内切酶靶序列、并且在该一对核酸内切酶靶序列外侧具有用于与上述转化辅助用质粒同源重组的上述一对同源重组序列。(4)根据(1)所述的转化物的制造方法，其特征在于，上述转化辅助用质粒具有可表达的特异性切割上述核酸内切酶靶序列的双链的靶特异性核酸内切酶基因。(5)根据(4)所述的转化物的制造方法，其特征在于，上述靶特异性核酸内切酶基因为归巢核酸内切酶基因。(6)根据(5)所述的转化物的制造方法，其特征在于，上述核酸内切酶靶序列为归巢核酸内切酶特异性识别的序列。(7)根据(4)所述的转化物的制造方法，其特征在于，上述转化辅助用质粒具有控制上述靶特异性核酸内切酶基因的表达的诱导型启动子。(8)根据(1)所述的转化物的制造方法，其特征在于，上述多种线状基因组导入核酸片段由第1线状基因组导入核酸片段至第n线状基因组导入核酸片段(n为2以上的整数)组成，第m线状基因组导入核酸片段(m为满足1≤m≤n－1的整数)3’末端侧具有与第m+1线状基因组导入核酸片段5’末端侧同源重组的序列。(9)一种转化方法，其特征在于，具有：将具有用于导入至基因组上的规定位置的目的基因的1种或多种线状基因组导入核酸片段和具有用于组入该线状基因组导入核酸片段的一对同源重组序列的转化辅助用质粒导入宿主的工序，其中，配置用于在上述线状基因组导入核酸片段组入转化辅助用质粒的状态下在上述目的基因外侧和基因组的规定位置进行同源重组的一对同源重组序列和在该一对同源重组序列外侧的一对核酸内切酶靶序列，上述目的基因是表达的。(10)根据(9)所述的转化方法，其特征在于，上述转化辅助用质粒具有与本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种转化物的制造方法，具有：/n将具有用于导入至基因组上的规定位置的目的基因的1种或多种线状基因组导入核酸片段和具有用于组入该线状基因组导入核酸片段的一对同源重组序列的转化辅助用质粒导入宿主的工序；/n筛选上述目的基因组入上述宿主基因组中的上述规定位置、表达上述目的基因的转化物的工序，/n其中在上述线状基因组导入核酸片段组入转化辅助用质粒的状态下在上述目的基因外侧配置用于在基因组的规定位置进行同源重组的一对同源重组序列和在该一对同源重组序列外侧配置一对核酸内切酶靶序列。/n

【技术特征摘要】
20190624 JP 2019-1163581.一种转化物的制造方法，具有：
将具有用于导入至基因组上的规定位置的目的基因的1种或多种线状基因组导入核酸片段和具有用于组入该线状基因组导入核酸片段的一对同源重组序列的转化辅助用质粒导入宿主的工序；
筛选上述目的基因组入上述宿主基因组中的上述规定位置、表达上述目的基因的转化物的工序，
其中在上述线状基因组导入核酸片段组入转化辅助用质粒的状态下在上述目的基因外侧配置用于在基因组的规定位置进行同源重组的一对同源重组序列和在该一对同源重组序列外侧配置一对核酸内切酶靶序列。


2.根据权利要求1所述的转化物的制造方法，其特征在于，上述转化辅助用质粒具有与上述线状基因组导入核酸片段中的目的基因外侧同源重组的一对同源重组序列和在介由该同源重组序列而组入上述线状基因组导入核酸片段的位置的相反侧配置的一对核酸内切酶靶序列。


3.根据权利要求1所述的转化物的制造方法，其特征在于，上述线状基因组导入核酸片段在夹着上述目的基因的位置具有用于组入上述基因组的规定位置的上述一对同源重组序列、在该一对同源重组序列外侧具有上述一对核酸内切酶靶序列、并且在该一对核酸内切酶靶序列外侧具有用于与上述转化辅助用质粒同源重组的上述一对同源重组序列。


4.根据权利要求1所述的转化物的制造方法，其特征在于，上述转化辅助用质粒具有可表达的特异性切割上述核酸内切酶靶序列的双链的靶特异性核酸内切酶基因。


5.根据权利要求4所述的转化物的制造方法，其特征在于，上述靶特异性核酸内切酶基因为归巢核酸内切酶基因。


6.根据权利要求5所述的转化物的制造方法，其特征在于，上述核酸内切酶靶序列为归巢核酸内切酶特异性识别的序列。


7.根据权利要求4所述的转化物的制造方法，其特征在于，上述转化辅助用质粒具有控制上述靶特异性核酸内切酶基因的表达的诱导型启动子。


8.根据权利要求1所述的转化物的制造方法，其特征在于，上述多种线状基因组导入核酸片段由第1线状基因组导入核酸片段至第n线状基因组导入核酸片段组成，第m线状基因组导入核酸片段3’末端侧具有与第m+1线状基因组导入核酸片段5’末端侧同源重组的序列，其中，n为2以上的整数，m为满足1≤m≤n－1的整数。


9.一种转化方法，其特征在于，具有：将具有用于导入至基因组上的规定位置的目的基因的1种或多种线状基因组导入核酸片段和具有用于组入该线状基因组导入核酸片段的一对同源重组序列的转化辅助用质粒导入宿主的工序，
其中在上述线状基因组导入核酸片段组入转化辅助用质粒的状态下在上述目的基因外侧配置用于在基因组的规定位置进行同源...

【专利技术属性】
技术研发人员：大西彻，多田宣纪，
申请(专利权)人：丰田自动车株式会社，
类型：发明
国别省市：日本;JP