一种通过多位点整合表达框提高毕赤酵母分泌表达猪γ干扰素的方法技术

本发明专利技术公开了一种通过多位点整合表达框提高毕赤酵母分泌表达猪γ干扰素的方法，包括如下步骤：S1.优化猪γ干扰素基因序列；S2.构建表达载体pPICZαA‑pIFNg；S3.构建表达载体pPIC9K‑pIFNg；S4.构建分泌表达猪γ干扰素的毕赤酵母工程菌；S5.诱导表达重组猪γ干扰素；通过在毕赤酵母基因组的醇氧化酶‑1基因位点和三功能组氨酸脱氢酶基因位点分步整合带有博来霉素和遗传霉素抗性基因的猪γ干扰素表达盒；通过多位点整合和不同抗生素标记加压筛选，提高猪γ干扰素的表达量，使猪γ干扰素的分泌表达量提高到1.33g/L，比现有技术提高了30％，而且重组毕赤酵母菌株稳定性高。

A method to improve the secretion and expression of porcine interferon gamma by Pichia pastoris by multi site integration expression frame

【技术实现步骤摘要】
一种通过多位点整合表达框提高毕赤酵母分泌表达猪γ干扰素的方法
本专利技术涉及生物技术和基因工程的
，特别涉及一种提高毕赤酵母分泌表达猪γ干扰素的方法。
技术介绍
干扰素(Interferon)是动物机体在病毒等的刺激下产生的一种具有抗病毒活性的细胞因子,动物机体内的干扰素是经过糖基化的蛋白质。根据其来源、结构及其受体不同可分为I型、II型和III型，每种类型又包含不同的亚型。目前只有I型中的α和β干扰素以及II型中的γ干扰素被批准应用于预防和治疗病毒感染。I型干扰素抗病毒活性较强，II型干扰素具有较强的免疫调节活性(包括刺激抗原特异性免疫和先天细胞免疫等)。Lefevre等人(Lefevre,F.,LaBonnardiere,C.,1986.Molecularcloningandsequencingofageneencodingbiologicallyactiveporcinealpha-interferon.J.Interferon.Res.6,349–360.)(Lefevre,F.,L’Haridon,R.,Borras-Cuesta,F.,LaBonnardiere,C.,1990.Production,purificationandbiologicalpropertiesofanEscherichiacoli-derivedrecombinantporcinealphainterferon.J.Gen.Virol.71(Pt5),1057–1063.)先后于1986和1990年克隆了猪的α和γ干扰素，他们还最早在大肠杆菌中表达了猪的α和γ干扰素，证明了重组猪α干扰素对伪狂犬病毒(PRV)、水泡性口膜炎病毒(VSV)、传染性胃肠炎病毒(TGEV)、流感病毒(SIV)、繁殖呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)和口蹄疫病毒(FMDV)都有较强的抗病毒活性，而重组猪γ干扰素除对VSV、TGEV、PRRSV和FMDV有明显的抗病毒活性外，对经典猪瘟病毒(CSFV)也有活性。毕赤酵母表达系统是最常用的蛋白质表达系统之一，毕赤酵母遗传背景清晰、基因操作简便、重组蛋白质表达水平高、具有翻译后修饰并能够分泌到细胞外等优点。中国专利号CN106319001A提供了一种重组干扰素γ的产业化制备方法与应用，将猪干扰素γ在大肠杆菌中以包涵体的形式进行表达，并经复性提纯成功制备了有活性的猪干扰素γ。中国专利号CN106676151A提供了一种重组猪干扰素γ成品冻干制剂的制备方法，将干扰素γ与硫氧化还原蛋白融合在大肠杆菌中以可溶性形式进行了表达。用大肠杆菌做宿主表达干扰素的优点是发酵周期短，缺点是包涵体形式的干扰素没有活性，需要进行复性，而以融合蛋白形式表达的干扰素也只是有一部分以有活性的可溶性蛋白形式表达，同时有一部分形成无活性的包涵体。此外，大肠杆菌表达的干扰素不能分泌到细胞外，需要收集菌体破碎细胞才能进行提纯，而大肠杆菌细胞壁中的脂多糖(内毒素)对动物机体是致热源，在纯化过程中必须完全去除。利用毕赤酵母生产的分泌型干扰素是活性形式，而且由于毕赤酵母分泌到胞外的杂蛋白较少，纯化比较容易。可见，现有技术还有待改进和提高。
技术实现思路
鉴于上述现有技术的不足之处，本专利技术的目的在于提供一种通过多位点整合表达框提高毕赤酵母分泌表达猪γ干扰素的方法，旨在解决现有技术中以包涵体形式表达的重组猪γ干扰素没有活性，以融合蛋白形式表达的猪γ干扰素活性低，提纯步骤复杂，以及毕赤酵母分泌表达猪γ干扰素表达量低，菌株稳定性差的技术问题。为了达到上述目的，本专利技术采取了以下技术方案：一种通过多位点整合表达框提高毕赤酵母分泌表达猪γ干扰素的方法，包括如下步骤：S1.优化猪γ干扰素基因序列；S2.构建表达载体pPICZαA-pIFNg：双酶切pPICZαA表达质粒，连接同样经过双酶切处理的重组猪γ干扰素基因片段，转化Top10大肠杆菌感受态，提取质粒双酶切鉴定阳性重组质粒，获得猪γ干扰素表达载体pPICZαA-pIFNg；S3.构建表达载体pPIC9K-pIFNg：双酶切pPIC9K表达质粒，连接同样经过双酶切处理的重组猪γ干扰素基因片段，转化Top10大肠杆菌感受态，提取质粒双酶切鉴定阳性重组质粒，获得猪γ干扰素表达载体pPIC9K-pIFNg；S4.构建分泌表达猪γ干扰素的毕赤酵母工程菌：单酶切pPICZαA-pIFNg表达载体，电转至感受态细胞，培养至长出单菌落，结合博来霉素加压筛选，筛选出菌株pIFNg-01；单酶切pPIC9K-pIFNg表达载体，电转至感受态细胞，培养至长出单菌落，结合遗传霉素加压筛选，筛选出表达量最高的菌株pIFNg-02；S5.诱导表达重组猪γ干扰素：挑取步骤S4中的表达猪γ干扰素的毕赤酵母菌株pIFNg-02，制备种子液，种子液发酵培养，饲喂碳源，甲醇诱导表达。所述的通过多位点整合表达框提高毕赤酵母分泌表达猪γ干扰素的方法中，所述优化后猪γ干扰素基因序列包括如SEQIDNo.1所示的DNA序列。所述的通过多位点整合表达框提高毕赤酵母分泌表达猪γ干扰素的方法中，所述步骤S2中使用XhoI和XbaI双酶切pPICZαA表达质粒、重组猪γ干扰素基因片段，用XhoI和XbaI双酶切鉴定阳性重组质粒。所述的通过多位点整合表达框提高毕赤酵母分泌表达猪γ干扰素的方法中，所述步骤S3中使用EcoRI和NotI双酶切pPIC9K表达质粒、重组猪γ干扰素基因片段，用EcoRI和NotI双酶切鉴定阳性重组质粒。所述的通过多位点整合表达框提高毕赤酵母分泌表达猪γ干扰素的方法中，所述步骤S4中还包括将单菌落接种培养后，用甲醇诱导表达，取发酵液上清电泳并染色，比较猪γ干扰素表达量。所述的通过多位点整合表达框提高毕赤酵母分泌表达猪γ干扰素的方法中，所述步骤S4中博来霉素的浓度梯度为0.4mg/ml、0.8mg/ml、1.2mg/ml、1.6mg/ml。所述的通过多位点整合表达框提高毕赤酵母分泌表达猪γ干扰素的方法中，所述步骤S4中遗传霉素的浓度梯度为0.4mg/ml、0.8mg/ml。所述的通过多位点整合表达框提高毕赤酵母分泌表达猪γ干扰素的方法中，所述步骤S4中单酶切pPICZαA-pIFNg表达载体的酶为PmeI限制性内切酶；单酶切pPIC9K-pIFNg表达载体的酶为SalI限制性内切酶。所述的通过多位点整合表达框提高毕赤酵母分泌表达猪γ干扰素的方法中，所述步骤S4中感受态细胞为X33毕赤酵母、GS115毕赤酵母或KM71毕赤酵母中的一种。所述的通过多位点整合表达框提高毕赤酵母分泌表达猪γ干扰素的方法中，所述的表达猪γ干扰素的毕赤酵母的保藏编号为：GDMCCNO.60827。有益效果：本专利技术提供了一种通过多位点整合表达框提高毕赤酵母分泌表达猪γ干扰素的方法，通过在毕赤酵母基因组的醇氧化酶-1(Alcoholoxidase1,AOX1)基因位点和三功能组氨酸脱氢酶(Trifunctionalhistid本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种通过多位点整合表达框提高毕赤酵母分泌表达猪γ干扰素的方法，其特征在于，包括如下步骤：/nS1.优化猪γ干扰素基因序列；/nS2.构建表达载体pPICZαA-pIFNg：双酶切pPICZαA表达质粒，连接同样经过双酶切处理的重组猪γ干扰素基因片段，转化Top10大肠杆菌感受态，提取质粒双酶切鉴定阳性重组质粒，获得猪γ干扰素表达载体pPICZαA-pIFNg；/nS3.构建表达载体pPIC9K-pIFNg：双酶切pPIC9K表达质粒，连接同样经过双酶切处理的重组猪γ干扰素基因片段，转化Top10大肠杆菌感受态，提取质粒双酶切鉴定阳性重组质粒，获得猪γ干扰素表达载体pPIC9K-pIFNg；/nS4.构建分泌表达猪γ干扰素的毕赤酵母工程菌：单酶切pPICZαA-pIFNg表达载体，电转至感受态细胞，培养至长出单菌落，结合博来霉素加压筛选，筛选出菌株pIFNg-01；单酶切pPIC9K-pIFNg表达载体，电转至感受态细胞，培养至长出单菌落，结合遗传霉素加压筛选，筛选出表达量最高的菌株pIFNg-02；/nS5.诱导表达重组猪γ干扰素：挑取步骤S4中的表达猪γ干扰素的毕赤酵母菌株pIFNg-02，制备种子液，种子液发酵培养，饲喂碳源，甲醇诱导表达。/n...

【技术特征摘要】
1.一种通过多位点整合表达框提高毕赤酵母分泌表达猪γ干扰素的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.优化猪γ干扰素基因序列；
S2.构建表达载体pPICZαA-pIFNg：双酶切pPICZαA表达质粒，连接同样经过双酶切处理的重组猪γ干扰素基因片段，转化Top10大肠杆菌感受态，提取质粒双酶切鉴定阳性重组质粒，获得猪γ干扰素表达载体pPICZαA-pIFNg；
S3.构建表达载体pPIC9K-pIFNg：双酶切pPIC9K表达质粒，连接同样经过双酶切处理的重组猪γ干扰素基因片段，转化Top10大肠杆菌感受态，提取质粒双酶切鉴定阳性重组质粒，获得猪γ干扰素表达载体pPIC9K-pIFNg；
S4.构建分泌表达猪γ干扰素的毕赤酵母工程菌：单酶切pPICZαA-pIFNg表达载体，电转至感受态细胞，培养至长出单菌落，结合博来霉素加压筛选，筛选出菌株pIFNg-01；单酶切pPIC9K-pIFNg表达载体，电转至感受态细胞，培养至长出单菌落，结合遗传霉素加压筛选，筛选出表达量最高的菌株pIFNg-02；
S5.诱导表达重组猪γ干扰素：挑取步骤S4中的表达猪γ干扰素的毕赤酵母菌株pIFNg-02，制备种子液，种子液发酵培养，饲喂碳源，甲醇诱导表达。


2.根据权利要求1所述的通过多位点整合表达框提高毕赤酵母分泌表达猪γ干扰素的方法，其特征在于，所述优化后猪γ干扰素基因序列包括如SEQIDNo.1所示的DNA序列。


3.根据权利要求1所述的通过多位点整合表达框提高毕赤酵母分泌表达猪γ干扰素的方法，其特征在于，所述步骤S2中使用XhoI和XbaI双酶切pPICZαA表达质粒、重组猪γ干扰素基因片段，用XhoI和XbaI双酶切鉴定阳性重组质粒。

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【专利技术属性】
技术研发人员：李伟，付建华，张志清，
申请(专利权)人：广东海纳川生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44