一种协同降解发酵玉米秸秆转化成高品质生物饲料原料的方法技术

本发明专利技术属于生物饲料领域，涉及一种协同降解发酵玉米秸秆转化成高品质生物饲料原料的方法；首先将来源于Irpex lacteus的锰过氧化物酶基因序列进行偏爱性优化，以优化的基因为模板进行PCR扩增，与pREP连接后转化到大肠杆菌感受态细胞中，获得重组穿梭质粒并导入缺陷型粟酒裂殖酵母感受态细胞中，得到重组锰过氧化物酶酵母工程菌；然后与粗糙脉胞菌、重组S.pombe‑man和产阮假丝酵母混合，添加氮源、氯化钙、硫酸锰、漆酶、葡萄糖氧化酶和小分子物质激活剂进行菌酶协同混菌发酵玉米秸秆；本发明专利技术合理利用农业废弃物，能够有效促进秸秆中木质纤维素的转化，在短时间内显著提高发酵饲料的品质，获得高品质生物饲料。

【技术实现步骤摘要】
一种协同降解发酵玉米秸秆转化成高品质生物饲料原料的方法
本专利技术属于生物饲料领域，具体涉及一种协同降解发酵玉米秸秆转化成高品质生物饲料原料的方法。
技术介绍
2019年中国科协发布20大重大科学问题和工程技术难题，废弃物资源生态安全利用技术集成排行在列。随着我国农业现代化的不断推进，农区耕地面积短缺与规模化牛羊静养需求大量优质粗饲料之间的矛盾日益突显，特别是在我国南方地区，优质粗饲料短缺是制约南方反刍动物大规模养殖的瓶颈之一。我国不仅是农业大国也是畜牧养殖业大国，每年产生大量的农业废弃物理应满足畜牧养殖的牧草饲料供应要求，但国内依然大量进口国外的优质牧草饲料。利用青储、黄储或微储技术保存秸秆新鲜度对养殖户的场地资金投入、人力物力都提出了较大的挑战，最主要问题是对秸秆饲料品质提升，包括木质素降低和真蛋白提高极有限。养殖户将新鲜的秸秆晒干以便秋冬时节饲喂牛羊，但这种秸秆细胞壁厚、木质素多，真蛋白极低，多种营养物质流失，导致饲料适口性差，阻碍养分的消化和吸收。很多报道表明，玉米秸秆中的纤维素被木质素和半纤维素紧密包被，阻碍了纤维素酶、半纤维素酶与纤维素、半纤维素的接触，这是木质纤维素转化过程中的关键问题。目前市场上已有商品化的纤维素酶和半纤维素酶，但是木质素降解酶系中只有漆酶和葡萄糖氧化酶，而锰过氧化物酶可以氧化木质素中的酚类结构单元及其他难以降解的化学结构，是一种重要的木质素降解酶，但还没有市场供应。目前，生物饲料原料发酵过程中较重视纤维素和半纤维素的酶解，以木质素为突破口的发酵工艺报道较少，特别是采用菌酶协同混菌发酵以综合提高真蛋白，降解木质素，适量降解纤维素和半纤维素，而且在发酵过程中联合多种小分子物质协同转化的报道更加缺乏。
技术实现思路
针对上述现有技术存在的不足，本专利技术的目的是协同降解玉米秸秆，构建一株重组锰过氧化物酶酵母工程菌，并提供一种经济安全高效的发酵方式，多酶协同混菌降解发酵玉米秸秆，短时间内显著提高玉米秸秆发酵饲料的品质。本专利技术所述的菌酶协同混菌发酵方式，把玉米秸秆转化成高品质生物粗饲料原料。为实现上述专利技术目的，本专利技术采取的技术方案为：(1)将来源于Irpexlacteus的锰过氧化物酶基因序列根据粟酒裂殖酵母密码子偏爱性进行优化，得到编码锰过氧化物酶的基因，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；(2)以步骤(1)中所述的编码锰过氧化物酶的基因为模板，进行PCR扩增，与穿梭质粒载体pREP连接后转化到大肠杆菌感受态细胞中，抽提获得重组穿梭质粒后，利用电转化法导入到缺陷型粟酒裂殖酵母感受态细胞中，得到重组锰过氧化物酶酵母工程菌，即S.pombe-pREP-mnp；(3)协同降解发酵玉米秸秆转化成高品质生物饲料原料：首先将步骤(2)中所述的重组锰过氧化物酶酵母工程菌与粗糙脉胞菌(N.crassa)、重组S.pombe-man和产朊朊假丝酵母(C.utilis)混合，并添加氮源、CaCl2、MnSO4、漆酶、葡萄糖氧化酶和小分子物质激活剂进行菌酶协同混菌发酵玉米秸秆；并控制上述添加的所有物质组成的发酵体系中的含水量。优选的，步骤(2)中所述重组穿梭质粒为pREP-mnp。优选的，步骤(2)中所述的大肠杆菌是6-磷酸葡萄糖胺合成酶缺陷型大肠杆菌；需要在含有葡萄糖胺的培养基中生长，无抗性基因，具有生物安全性。优选的，步骤(2)中所述的缺陷型粟酒裂殖酵母是6-磷酸果糖氨基转移酶缺陷型粟酒裂殖酵母；需要在含有葡萄糖胺的培养基中生长，具有生物安全性的食品级酵母菌。优选的，步骤(3)中所述的重组S.pombe-man发酵菌株是将来源于枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的甘露聚糖酶基因序列，根据粟酒裂殖酵母密码子偏爱性进行优化后导入粟酒裂殖酵母中，构建的一株重组甘露聚糖酶酵母工程菌，记为S.pombe-man。优选的，步骤(3)中所述N.crassa、S.pombe-pREP-mnp、S.pombe-man和C.utilis的总接菌量为1％-15％；所述粗糙脉胞菌、S.pombe-pREP-mnp、S.pombe-man和C.utilis的接种体积比例为2:4:4:2；整个发酵体系中的总含水量为50％-70％。优选的，步骤(3)中所述的氮源由尿素和硫酸铵组成，其中尿素的用量为玉米秸秆质量的0.5％-1％，硫酸铵的用量为玉米秸秆质量的1％-4％。优选的，步骤(3)中所述CaCl2的用量为玉米秸秆质量的0.1％-1％，MnSO4的用量为玉米秸秆质量的0.1％-0.7％，葡萄糖氧化酶(GOD)的用量为玉米秸秆质量的0.2％-0.6％，漆酶(Lac)的用量为玉米秸秆质量的0.1％-1％。优选的，步骤(3)中所述漆酶的酶活力为10000U/g，葡萄糖氧化酶的酶活力为200U/g。优选的，步骤(3)中所述小分子物质激活剂为草酸和Tween-80；所述草酸在发酵体系中的终浓度为0.2-1mM，复配0.02％Tween-80，即Tween-80的用量为玉米秸秆质量的0.02％。优选的，步骤(3)中所述发酵的温度为26-37℃，发酵时间为2-4天。本专利技术制备的重组锰过氧化物酶酵母工程菌还可应用于酶解玉米秸秆木质素，也可用于造纸等用途，具体步骤如下：培养步骤(2)中所述的重组酵母工程菌，得到菌液，离心收集粗酶液，粗酶液中包含重组酵母工程菌胞外分泌的锰过氧化物酶；并添加CaCl2、MnSO4、漆酶、葡萄糖氧化酶和小分子物质激活剂进行多酶协同酶解玉米秸秆木质素。优选的，所述重组锰过氧化物酶在酶解过程中的适宜反应温度为20～50℃，适宜pH为2.0～4.0。优选的，所述多酶协同酶解玉米秸秆木质素：玉米秸秆与粗酶液的料液比为0.5-5:1；CaCl2的用量为玉米秸秆质量的0.1％-1％，MnSO4的用量为玉米秸秆质量的0.1％-0.7％，葡萄糖氧化酶的用量为玉米秸秆质量的0.2％-0.6％，漆酶的用量为玉米秸秆质量的0.1％-1％。优选的，所述漆酶的酶活力为10000U/g，葡萄糖氧化酶的酶活力为200U/g。优选的，所述小分子物质激活剂由草酸和Tween-80组成；所述草酸在酶解体系中的终浓度为0.2-1mM复配0.02％Tween-80，即Tween-80的用量为玉米秸秆质量的0.02％。其中，漆酶和葡萄糖氧化酶购自夏盛(北京)生物科技开发有限公司，为普通饲料级商业化酶制剂，商场上均可购买；粟酒裂殖酵母、粗糙脉胞菌和产朊假丝酵母购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。本专利技术的优点和技术效果是：(1)本专利技术提供一种具有生物安全性食品级重组锰过氧化物酶酵母工程菌，可以快速地获取大量锰过氧化物酶，实现锰过氧化物酶的工业化生产，获得良好稳定的过氧化物酶产品，用于木质素的降解。本申请中所制备的锰过氧化物酶的适宜反应温度为20～50℃，适宜pH为2.0～4.0，具有更为优良的耐酸性能；大量实验表明其联合Ca2+、Mn2+共同降解木质素时可以显著提高木质素的降解率，另本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种协同降解发酵玉米秸秆转化成高品质生物饲料原料的方法，其特征在于，步骤如下：/n(1)将来源于Irpex lacteus的锰过氧化物酶基因序列根据粟酒裂殖酵母密码子偏爱性进行优化，得到编码锰过氧化物酶的基因；/n(2)以步骤(1)中所述的编码锰过氧化物酶的基因为模板，进行PCR扩增，与穿梭质粒载体pREP连接后转化到大肠杆菌感受态细胞中，抽提获得重组穿梭质粒后，利用电转化法导入到缺陷型粟酒裂殖酵母感受态细胞中，得到重组锰过氧化物酶酵母工程菌，即S.pombe-pREP-mnp；/n(3)协同降解发酵玉米秸秆转化成高品质生物饲料原料：首先将步骤(2)中所述的重组锰过氧化物酶酵母工程菌与粗糙脉胞菌、重组S.pombe-man和产朊假丝酵母混合，并添加氮源、CaCl

【技术特征摘要】
1.一种协同降解发酵玉米秸秆转化成高品质生物饲料原料的方法，其特征在于，步骤如下：
(1)将来源于Irpexlacteus的锰过氧化物酶基因序列根据粟酒裂殖酵母密码子偏爱性进行优化，得到编码锰过氧化物酶的基因；
(2)以步骤(1)中所述的编码锰过氧化物酶的基因为模板，进行PCR扩增，与穿梭质粒载体pREP连接后转化到大肠杆菌感受态细胞中，抽提获得重组穿梭质粒后，利用电转化法导入到缺陷型粟酒裂殖酵母感受态细胞中，得到重组锰过氧化物酶酵母工程菌，即S.pombe-pREP-mnp；
(3)协同降解发酵玉米秸秆转化成高品质生物饲料原料：首先将步骤(2)中所述的重组锰过氧化物酶酵母工程菌与粗糙脉胞菌、重组S.pombe-man和产朊假丝酵母混合，并添加氮源、CaCl2、MnSO4、漆酶、葡萄糖氧化酶和小分子物质激活剂进行菌酶协同混菌发酵玉米秸秆；并控制所有物质组成的发酵体系的含水量；所述的重组S.pombe-man发酵菌株是将来源于枯草芽孢杆菌的甘露聚糖酶基因序列，根据粟酒裂殖酵母密码子偏爱性进行优化后导入粟酒裂殖酵母中，构建的一株重组甘露聚糖酶酵母工程菌，记为S.pombe-man。


2.根据权利要求1所述的协同降解发酵玉米秸秆转化成高品质生物饲料原料的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述重组穿梭质粒为pREP-mnp；所述的大肠杆菌是6-磷酸葡萄糖胺合成酶缺陷型大肠杆菌。


3.根据权利要求1所述的协同降解发酵玉米秸秆转化成高品质生物饲料原料的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的缺陷型粟酒裂殖酵母是6-磷酸果糖氨基转移酶缺陷型粟酒裂殖酵母。


4.根据权利要求1所述的协同降解发酵玉米秸秆转化成高品质生物饲料原料的方法，其特征在于，步骤(3)中所述粗糙脉胞菌、S.pombe-pREP-mnp、S.pombe-man和产朊假丝酵母的总接菌量为1％-15％；所述粗糙脉胞菌、S.pombe-pREP-mnp、S.pombe-man和产朊假丝酵母的接种体积比例为2:4:4:2；整个发酵体系中的总含水量为50％-70％。


5.根据权利要求1所述的协同降解发酵玉米秸秆转化成高品质生物饲料原料的方法，其特征在于，步骤(3)中所述的氮源由尿素和硫酸铵组成，其中尿素的用量为玉米秸秆质量的0.5％-1％，...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈华友，崔周磊，王洪成，蔡康涛，梁晓玉，齐向辉，崔凤杰，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32