一种PCCI-2U质粒及其构建方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种PCCI‑2U质粒及其构建方法和应用，所述的质粒命名为PCCI‑2U，质粒包括repE基因、sopA基因、sopB基因、sopC基因、ori2复制子、oriV复制子、原核转录终止子T3te和tonB终止子、trp基因和yeast 2μ复制子基因。本发明专利技术的提供的一种PCCI‑2U质粒及其构建方法和应用，在大肠杆菌中具有拷贝数低、容量大、稳定性高等特点，在酵母中依赖高拷贝的2μ复制子能稳定复制，具有编码色氨酸的TRP基因，可以利用SC‑rtp半合成培养基进行筛选。本发明专利技术的PCCI‑2U可用长基因的酵母内组装，用于长片段基因、结构复杂基因的克隆、筛选、测序和基因组的构建等基因工程领域。

【技术实现步骤摘要】
一种PCCI-2U质粒及其构建方法和应用
本专利技术属于生物技术及基因工程领域，具体涉及一种能够在单拷贝和中拷贝之间切换、大容量、高稳定性的酵母-大肠穿梭载体PCCI-2U质粒的构建方法和应用。
技术介绍
现代生物学建立以来，从解码一个人的基因组计划的人类基因组计划，到分析人群差异性的HapMap，再到利用基因组围剿疾病的GWAS以及现在的精准医疗，在基因组巨大的宝藏之中，人类的探索从未停止。现在科学家已经有能力从头建构或者重编程大肠杆菌或者酵母的基因组。基因组组装技术基于大规模基因组数据分析,发现新型的或隐藏的生物活性物质合成基因簇。利用基因组装技术,可提高或激活沉默的生物合成基因簇在微生物中的表达,从而合成潜在的、有价值的生物活性物质。TAR(转化重组技术)是利用酿酒酵母体内高效的同源重组系统实现多个具有末端重叠序列的DNA片段的一步组装方法，它不仅能够方便地将较短的DNA片段组装成较长的DNA片段，甚至还能够实现整个基因组的组装。2016年3月，测序和合成生物学先驱CraigVenter及其同事们宣布，他们重编码了支原体细菌的基因组，将其基因组大小从约一百万碱基减少到五十万碱基，使用TAR技术创建了“最小”基因组——这是目前维持生命所需的最小基因组。酵母菌也有质粒存在，这种2pm长的质粒称为2um质粒，约6300bp。这种质粒至少有一段时间存在于细胞核内染色体以外，利用2um质粒和大肠杆菌中的质粒可以构建成能穿梭于细菌与酵母菌细胞之间的穿梭质粒。酵母克隆载体都是在这个基础上构建的。应用TAR克隆方法需要将DNA克隆到大肠-酵母穿梭载体。人们为了克隆大片段DNA，创造了很多人工染色体载体，例如酵母人工染色体YAC，大肠杆菌人工染色体BAC。酵母人工染色体YAC能够用于克隆100-1000kb的基因组，容量远远大于大肠人工染色体BAC载体，YAC载体的主要元件包括端粒序列CEN和自主复制序列ARS，能够确保载体能随着酵母的有丝分裂稳定复制。YAC载体的主要元件也包括筛选标记基因，例如合成亮氨酸的leu基因，当转化leu基因突变的酵母菌株，涂布于缺少亮氨酸的培养基SC-LEU时，只有含YAC载体的酵母克隆才能在平板上生长。大片段DNA的克隆伴随的问题有：常规载体克隆大片段DNA有容量限制，克隆20k以上的基因时往往出现序列缺失，克隆失败等问题。克隆的DNA基因转录对大肠杆菌有毒性的RNA或编码毒性蛋白时，会导致大肠杆菌死亡，最终无法获得阳性克隆的质粒。大片段DNA基因存在毒性基因及不稳定基因的概率大于小片段DNA，因此更难于克隆。常规克隆载体DNA序列包括复制子、抗性基因、多克隆位点序列，载体序列上的启动子可能会对插入序列进行通读和转录，或插入序列中的启动子可能会发生序列通读，影响载体元件的基因表达，这也会导致基因的克隆失败。序列通读会导致外源基因的转录翻译，可能导致外源DNA的克隆失败。序列通读指的是RNA聚合酶结合启动子序列，持续转录RNA，在终止子位置从DNA上脱落，如果没有终止子序列，RNA聚合酶会在转录当前基因后继续转录，一直到从DNA上脱落为止。利用BAC载体进行大片的DNA的克隆，相比常规克隆载体，例如PUC57，因为该载体在大肠中以单拷贝的形式存在，随大肠杆菌染色体一起复制，能够容纳更多的DNA片段，能够保持DNA的稳定性，能克隆不稳定的序列(发卡结构、重复序列、Z-DNA等)，包括克隆毒性基因(病毒基因组)。大肠杆菌基因工程载体的拷贝数由载体的复制子决定。质粒的复制子与细菌用来复制基因组的复制起点是分开的，受到不同的调控。例如，大肠杆菌质粒pBR322使用一种叫做Rop/Rom的蛋白质(来源于pMB1质粒)来调节每个细菌细胞内质粒的数量。这限制了每个细胞的质粒数量即拷贝数到30-40。更为常用的质粒包括pUC19在内的pUC系列质粒。与pBR322相比，它的ori存在点突变，并且删除了Rop/Rom基因。通过这些改变，每个细胞可以产生多达500个拷贝，这使得可以生产大量用于研究目的的DNA。质粒复制的其他来源包括pSC101(来自沙门氏菌，每个细胞约5份)、15A来源(来自p15A，每个细胞10-20份)和细菌人工染色体(每个细胞1份)。常规的细菌人工染色体BAC载体利用大肠杆菌F’因子的复制系统，包括repE、sopA、sopB、sopC基因，在大肠杆菌中保持一份拷贝。因此，相较常规克隆载体，BAC载体的质粒提取相对更加困难，因为质粒拷贝数是常规的几十分之一。要提取足够进行下游质粒酶切、测序等实验用的BAC质粒对实验室是个难题。Epicentre的PCCI-BAC载体具有可被诱导的oriⅤ复制起点，当BAC质粒转化可诱导表达TrfA的菌株后，在诱导剂存在的情况下，TrfA可激活oriⅤ复制起点，并使质粒拷贝数由每个细胞1个拷贝提高到每个细胞10-20个拷贝，从而提高质粒抽提量。
技术实现思路
针对现有技术中的上述不足，本专利技术提供了一种PCCI-2U质粒及其构建方法和应用，质粒是一种大肠-酵母穿梭载体，在大肠杆菌中具有拷贝数低、容量大、稳定性高的特点。为了达到上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案为：一种PCCI-2U质粒，所述PCCI-2U质粒包括trp基因和yeast2μ复制子基因、repE基因、sopA基因、sopB基因、sopC基因、ori2复制子、可经诱导使质粒拷贝数提高至约10个拷贝的oriV复制子、抗生素抗性基因以及原核转录终止子T3te和tonB，原核转录终止子位于克隆位点两端。优选的，所述抗生素抗性基为编码氯霉素乙酰转移酶的Cm基因，抗生素抗性基因可以为氨苄青霉素抗性基因(ampr)、卡那霉素抗性基因(kanr)、四环素抗性基因(Tetr)、链霉素抗性基因(Strr)和氯霉素抗性基因(Cmlr)、壮观霉素抗性基因(Sper)或庆大霉素基因(Gmr)。优选的，所述酵母中筛选标记基因为编码色氨酸的TRP基因，筛选标记基因可以为编码尿嘧啶的ura基因、编码亮氨酸的leu基因、编码组氨酸的His基因。优选的，所述酵母复制子基因为端粒序列和自主复制位点CEN-ARS，为酵母2μ复制子。本方案中选择的2μ复制子为高拷贝优选地，原核转录终止子为不依赖Rho因子的终止子，可以为噬菌体T7终止子、rrnB终止子以及T0终止子，噬菌体T3早期转录终止子T3Te，大肠杆菌tonB-P14转录终止子tonB。优选的，所述质粒具有如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，所述质粒中，自5’端第1bp～30bp为终止子T3Te，58bp～135bp为多克隆位点区域，155bp～186bp为终止子tonB，200bp～1156bp为Trp基因，1901bp～3243bp为2μ复制子基因，3388bp～4047bp为氯霉素基因，5008bp～5622bp为oriV基因，6008bp～6763bp为repE基因，7342bp～8517bp为sopA基因，8517bp～9488bp为sopB本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种pCCI-2U质粒，其特征在于，包括repE基因、sopA基因、sopB基因、sopC基因、ori2复制子、可经诱导使质粒拷贝数提高至10个拷贝的oriV复制子、抗生素抗性基因以及原核转录终止子T3te和tonB，所述原核转录终止子T3te和tonB位于克隆位点两端；/n所述pCCI-2U质粒中，自5’端第1bp～30bp为终原核转录终止子T3Te，58bp～135bp为多克隆位点区域，155bp～186bp为原核转录终止子tonB，200bp～1156bp为Trp基因，1901bp～3243bp为2μ复制子基因，3388bp～4047bp为氯霉素基因，5008bp～5622bp为oriV基因，6008bp～6763bp为repE基因，7342bp～8517bp为sopA基因，8517bp～9488bp为sopB基因，9561bp～10034bp为sopC基因。/n

【技术特征摘要】
1.一种pCCI-2U质粒，其特征在于，包括repE基因、sopA基因、sopB基因、sopC基因、ori2复制子、可经诱导使质粒拷贝数提高至10个拷贝的oriV复制子、抗生素抗性基因以及原核转录终止子T3te和tonB，所述原核转录终止子T3te和tonB位于克隆位点两端；
所述pCCI-2U质粒中，自5’端第1bp～30bp为终原核转录终止子T3Te，58bp～135bp为多克隆位点区域，155bp～186bp为原核转录终止子tonB，200bp～1156bp为Trp基因，1901bp～3243bp为2μ复制子基因，3388bp～4047bp为氯霉素基因，5008bp～5622bp为oriV基因，6008bp～6763bp为repE基因，7342bp～8517bp为sopA基因，8517bp～9488bp为sopB基因，9561bp～10034bp为sopC基因。


2.如权利要求1所述的一种PCCI-2U质粒，其特征在于：所述PCCI-2U质粒包括trp基因和yeast2μ复制子基因，所述PCCI-2U质粒在酵母中以高拷贝的特点维持，所述PCCI-2U质粒具有编码色氨酸的TRP基因。


3.如权利要求1所述的一种PCCI-2U质粒，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：开雷，杜攀，苏万凯，
申请(专利权)人：江苏赛索飞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32